人硒蛋白PcDNA探针的制备及其在肝脏组织中的表达.doc

人硒蛋白P cDNA探针的制备及其在肝脏组织中的表达 作者：南克俊 隋晨光 韩王月 刘彦仿 胡沛臻 秦海霞 景钊 刘陕西【关键词】 人硒蛋白PPreparation of human selenoprotein P cDNA probe and expression in human hepatic tissue【Abstract】 AIM: To investigate the expression of selenoprotein P mRNA in hepatic diseases, including cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC). METHODS: Selenoprotein P cDNA fragment was amplified by PCR the expression of Selenoprotein P mRNA was detected in 13 cases of normal liver, 20 cases of cirrhosis and 30 cases of hepatocellular carcinoma (HCC) by in situ hybridization. RESULTS: The PCR products evaluated by electrophoresis were as expected. The expression of selenoprotein P mRNA was found in the tissue stroma of liver, especially in the endothelial cells of vasculature. The positive expression rate of selenoprotein P mRNA was 84.6% (11/13), 50.0% (10/20), 20.0% (6/30) respectively in normal liver, cirrhosis and HCC. The rate of expression in hepatic carcinoma was significantly lower than that in others (2=15.84, P<0.005; 2=4.96, P<0.05). The positive blue granules were seen distributed in the nucleus and cytoplasm in normal liver and cirrhosis liver. The expression in nucleus of normal liver was significantly higher than that of cirrhosis liver. In HCC, the positive particles were located in cytoplasm, but nucleolus showed almost no staining. CONCLUSION: The expression of human selenoprotein P gene is significant different in the three kinds of liver tissues, suggesting that selenoprotein P may play a role in the occurrence and development of HCC.【Keywords】 human selenoprotein P; cDNA probes; PCR; in situ hybridization; carcinoma, hepatocellular【摘要】 目的： 探讨SeP基因与肝脏疾病特别是肝癌发生发展的关系. 方法： 采用美国Georgia大学惠赠的质粒PBluescriptHuman Selenoprotein P，用PCR法制备人SeP cDNA探针，检测了13例正常肝脏、20例肝硬化、30例肝癌组织中SeP mRNA的表达水平. 结果: PCR产物经电泳鉴定与预期相符. 3种肝脏组织的组织间质均有SeP mRNA表达，主要位于脉管区的血管内皮；正常肝细胞、肝硬化肝细胞及肝癌细胞中SeP mRNA阳性率分别为84.6%，50.0%，20.0%. 肝癌细胞阳性表达率明显低于其他两组（2=15.84, P<0.005; 2=4.96, P<0.05）. 正常肝细胞和肝硬化肝细胞的胞质及胞核内均出现蓝色的阳性颗粒，在胞核主要分布在核仁与核周；正常肝细胞的核阳性强于肝硬化肝细胞. HCC细胞阳性表达颗粒位于胞质，胞核几无表达. 结论: 人SeP cDNA探针制备成功，可用于人体组织SeP mRNA的原位检测. 肝癌细胞中存在SeP mRNA的表达缺失，SeP基因的缺失可能与肝癌的发生有关.【关键词】 人硒蛋白P；cDNA探针；PCR；原位杂交；癌，肝细胞0引言硒是人体必需的微量元素之一，参与GSHPx的合成，具有抗氧化损伤作用1，流行病学调查表明缺硒可导致恶性肿瘤的发生2. 实验证实食物中添加硒可以减少前列腺癌、结肠癌、肺癌及肝癌的发生3. 硒的许多生物学功能是通过硒蛋白来实现的，迄今已经发现了18种具有生物功能的硒蛋白，硒蛋白P（Selenoprotein P，SeP）是其中一种4. 人体几乎所有的组织中都含有SeP，近年来大量研究证实其与多种恶性肿瘤有关，已经成为研究的热点. 但从基因水平对肝癌组织中的SeP进行原位检测，目前尚少见报道. 因此我们制备了特异性的SeP cDNA探针，对正常肝脏、肝硬化、肝癌组织进行核酸原位杂交，检测其表达水平，探讨SeP与肝脏疾病特别是肝癌发生发展的关系.1材料和方法1.1材料质粒PBluescriptHuman Selenoprotein P由美国Georgia大学惠赠，全长为6.4 kb，为氨苄青霉素抗性（Amp+），宿主菌为JM109. 小量质粒提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司. Taq DNA聚合酶购自华美生物工程公司. DNA Marker购自大连Takara公司. 地高辛标记和检测试剂盒购自德国Boehringer Mannheim公司.13例正常肝脏标本取自非肝脏疾病的尸检患者及肝移植的供肝者，30例肝硬化及30例原发性肝细胞肝癌（HCC）标本取自西安交通大学第一医院1999/2001间手术切除标本，肝硬化和HCC均经病理诊断证实. 所有标本经40 g・L-1甲醛固定，常规石蜡包埋，4 m连续切片. HE染色复查切片.1.2方法1.2.1质粒的转化质粒PBluescriptHuman Selenoprotein P冷点在保鲜膜上，将剪碎的膜用20 L的TrisHCl缓冲液（TE pH 8.0）浸泡30 min，浸出液加入100 L JM109感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30 min，42热休克90 s，迅速置于冰上2 min，加入800 L LB培养基，37温浴45 min，5000 r・min-1离心5 min，留100 L上清混匀沉淀，涂布于已加入Amp（100 g・mL-1）的LB琼脂平板上，37培养过夜.1.2.2质粒的扩增和提取挑取琼脂平板上的单一菌落，接种于5 mL含Amp（100 g・mL-1）的LB培养基中，37摇床，100150 r・min-1，812 h. 以质粒提取试剂盒按说明提取质粒. 取5 L进行2 g・L-1的琼脂糖凝胶电泳检验质粒提取结果. 置于-20冰箱保存备用.1.2.3SeP cDNA探针的制备与标记根据SeP基因序列（GenBank access number：36425）使用Primer Premier软件（Version 5.0，PREMIER Biosoft Inc）设计鉴定引物. 上游引物5CTCCATCGCCTCATTACCAT3，下游引物5GAGGCAAACGTCACTGACAA3，扩增片段长度为447 bp（542988）. 引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，稀释浓度 25 mol・L-1. 以提取的质粒为模板，50 L反应体系中含有模板RNA 4 L，Taq DNA聚合酶（3 U・L-1，华美生物工程公司）1.5 L，引物各2 L，10PCR Buffer（MgCl2Free） 5 L，MgCl2（25 mmol・L-1） 2 L，4dNTP（2.5 mmol・L-1） 4 L，灭菌去离子水29.5 L. 循环参数为94 5 min，94 30 s，55 30 s，72 30 s，35个循环；72延伸7 min. 取5 L行2 g・L-1琼脂糖凝胶电泳检验扩增结果， 标准分子量marker为DL200015 000 DNA marker. 以PCR产物纯化试剂盒按说明纯化PCR产物，乙醇沉淀法浓缩. 用地高辛标记和检测试剂盒（德国Boehringer Mannheim）标记探针并进行检测，按试剂盒说明操作. 置-20冰箱保存备用.1.2.4SeP mRNA的原位杂交检测组织切片预处理：切片脱蜡至水，2 mL・L-1 Triton X100处理15 min，0.2 mol・L-1盐酸酸化15 min，5 mg・L-1蛋白酶K消化15 min，充分干燥. 杂交：向组织上滴加预杂交液37孵育1 h. 将杂交液100变性10 min，-20放置10 min，滴加于组织上，2SSC湿盒内37杂交过夜. 洗涤、显色：2.0SSC，1.0SSC，0.5SSC，Buffer充分洗涤，正常山羊血清封闭30 min，加DigAp （1500）37孵育2 h. Buffer洗涤，Buffer平衡组织，NBT/BCIP避光充分显色，清水终止反应，脱水、透明、封片，在光镜下观察结果. 设不加探针的预杂交液代替杂交液为空白对照.统计学处理： 采用2检验及确切概率法进行组间比较，以P<0.05为有显著性差异.2结果PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果在紫外灯下观察，在靠近500 bp的DNA Marker条带处可见明亮条带，大小约为450 bp，说明产物大小与预期相符(Fig 1).图1PCR产物在琼脂糖凝胶电泳结果(略)以SeP cDNA探针进行原位杂交检测，正常肝组织、肝硬化组织和HCC的组织间质均有SeP mRNA表达，特别是脉管区的血管内皮以及淋巴细胞表达丰富，3组无差别. 正常肝组织、肝硬化组织、HCC组织中的肝细胞胞质和（或）胞核的表达不同，以其内出现蓝色颗粒者为阳性，其阳性率分别为正常肝组织84.6%（11/13），肝硬化组织50.0%（10/20），HCC组织20.0%（6/30）. 3种肝细胞中SeP mRNA表达具有显著性差异（P<0.05；2=4.96，P<0.05）. 其中正常肝细胞和肝硬化肝细胞的胞质及胞核内均出现蓝色的阳性颗粒，在胞核主要分布在核仁与核周；正常肝细胞的核阳性强于肝硬化肝细胞（Fig 2）. HCC细胞中胞质内出现明显的蓝色颗粒，而胞核偶有表达（Fig 3A）. 空白对照细胞呈阴性，胞质和胞核内均无蓝色的阳性颗粒. Sep mRNA在肝脏组织间质中表达于基质中(Fig 3B).图2SeP mRNA在肝细胞核和细胞质中的表达(略)3讨论SeP是一种细胞外糖蛋白4，由硒元素和蛋白以硒半胱氨酸（Sec）的方式结合而成，每个肽链含有1012个Sec残基. SeP主要由肝细胞分泌，此外脑星形胶质细胞、小脑颗粒细胞、横纹肌细胞也可以产生5.原位杂交结果显示SeP mRNA在正常肝组织、肝硬化组织、肝细胞肝癌的组织间质均有表达，包括纤维结缔组织及血管内皮等部位. 这与以往的研究结论一致，即SeP可以表达于人类脉管系统的血管内皮6；免疫组化研究证实，SeP主要表达于小鼠的肝、肾、脑的内皮细胞7. SeP可与血浆中的血细胞膜结合，组织间质可能是SeP发挥作用的目标，SeP的碱图3SeP mRNA在肝癌细胞(A)和肝脏组织间质中(B)的表达(略)基片段可能会促进其与细胞表面和间质中糖质的结合. 肝脏组织中大量淋巴细胞也呈现SeP mRNA阳性.我们的结果显示正常肝细胞阳性表达率为84.6%，主要表达在胞质及胞核，在胞核中主要分布在核仁与核周，表明SeP mRNA由肝细胞产生后分泌入胞质. 肝硬化组肝细胞阳性表达率50.0%，较正常肝细胞明显下降，可能是由于肝细胞病变受损后，其合成SeP mRNA的能力下降. 肝癌细胞中SeP mRNA阳性表达率最低，且主要表达在胞质内，胞核几无表达，差异显著. 说明肝癌细胞中SeP基因可能有变异或缺失，此与肝癌的发生有一定关系. 结肠腺瘤组织中SeP mRNA的表达较癌周正常组织明显下降8. 在前列腺癌细胞中SeP基因水平也呈下降趋势9. 有研究利用二氨基萘荧光分析法测定肝癌组织及癌旁组织硒水平，发现肝癌组织中硒水平明显低于癌旁组织10. SeP蛋白是组织及血浆硒的主要供应蛋白11，因此癌组织中SeP基因变异或缺失可能正是肝癌组织硒含量较癌旁组织降低的主要原因.大宗人群检测表明，血清SeP蛋白的低水平与呼吸道、消化道肿瘤发生有关12. 既往认为SeP蛋白的合成主要由硒的供给决定，本实验证实在人肝癌细胞中SeP基因缺失，说明SeP蛋白的减少可能不仅仅是由于缺乏硒所造成，应考虑SeP基因变异或缺失与其有关. 在人肝癌细胞中，IFN，TNF，IL1及TGF1可抑制SeP启动子的活性，从而可降低SeP mRNA的表达水平，使SeP蛋白的产生减少13，14，因此可能在肝癌组织中一些细胞因子的异常导致了SeP mRNA的缺失. SeP具有抗氧化防御作用，然而SeP在抗癌中的具体作用，从目前实验结果来看尚不清楚，仍需进一步的研究.【参考文献】1 Liu XD, Gong SM, Yang RH, Chen JY, Deng ZR, Liu XH. Apoptosis of retina nervous cells induced by microwave and theprotective effects of selenium J. 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