人MASP1N端片段原核表达载体的构建及其表达.doc

人MASP1 N端片段原核表达载体的构建及其表达作者：蔡学敏, 赵娜, 左大明, 张丽芸, 陈政良【摘要】 目的: 在大肠杆菌中表达人甘露聚糖结合凝集素（MBL）相关丝氨酸蛋白酶1（MASP1）N端片段。方法: 采用PCR技术从含人MASP1 cDNA的质粒pGEMMASP1中扩增MASP1N端基因片段, 将其插入原核表达载体pGEX4T1, 转化BL21(DE3)感受态菌诱导表达MASP1N端蛋白, 通过GSTrap亲合层析柱纯化目的蛋白, 以SDSPAGE和Western blot进行鉴定, 并以ELISA分析了目的蛋白与重组MBLCLR、 重组MBL的结合活性。结果: 从pGEMMASP1中扩增得到约860 bp的基因片段, 构建成重组载体经酶切出现约4900 bp和860 bp片段,测序结果与预期的完全一致。纯化蛋白经SDSPAGE可见Mr 60000蛋白带, 该蛋白可与抗GST抗体反应并能与重组人MBLCLR、 重组人MBL蛋白结合。结论: 获得了表达人MASP1 N端片段的大肠杆菌菌株和重组人MASP1 N端片段/GST融合蛋白, 为MASP1分子的进一步研究提供了条件。 【关键词】 甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶1 N端片段 原核表达Abstract AIM: To express the Nterminal fragment of human mannanbinding lectin (MBL) associated serine proteases1 (MASP1N) in E.coli. METHODS: The target sequence in pGEMMASP1 plasmid that contains human MBLMASP1 cDNA was amplified by PCR, inserted into prokaryotic expression vector pGEX4T1 and identified by restriction mapping and sequencing. The recombinant expression vector was transformed into E.coli BL21 (DE3) cells. The expressed product was purified by GSTrap Immobilized Metal Affinity Chromatography(IMAC) and identified by SDSPAGE and Western blot assay, its bindingactivity with the collagenlike region of human MBL(MBLCLR) and with recombinant human MBL was analyzed by an indirect enzymelinked immunosorbent assay（ELISA）. RESULTS: The DNA fragment of 860 bp, which encode the Nterminal region of human MASP1, was amplified from pGEMMASP1 plasmid and the recombinant expression vector, pGEX4TMASP1N, was constructed, whose restriction maps and sequence were consistent with those expected. The component of Mr 60 000 in the purified recombinant product was found by SDSPAGE and could be recognized by antiGST antibody in Western blot assay. The purified recombinant product could react with human MBLCLR and human MBL in the indirect ELISA. CONCLUSION: The prokaryotic cell strain that expresses efficiently recombinant human MASP1N(rhMASP1N) protein and the purified rhMASP1N protein were successfully obtained, which provides the basis for further research of MASP1 molecule.Keywordsmannanbinding lectin associated serine protease1; Nterminal fragment; prokaryotic expression甘露聚糖结合凝集素（mannanbinding lectin, MBL）是由肝细胞分泌的血浆蛋白, 在血循环中与MBL相关丝氨酸蛋白酶（MBLassociated serine protease, MASP）形成复合物而发挥功能。MBL的糖识别域（carbohydraterecognition domain, CRD）能选择性识别多种病原体表面的糖结构, 而胶原样区（collagenlike region, CLR）为其效应功能区, 结合MASP的功能定位于此区。MBL与糖基配体结合后, 勿需C1和抗体参与即可通过MASP激活补体系统, 此即补体激活第三途径凝集素途径1-3。MASP1属于丝氨酸蛋白酶（serine proteases, SP）超家族成员, 为含6个功能区的单肽链分子: 从N端至C端依次为CUB区（complement subcomponent C1r/C1slike domain）、 EGF区（epidermal growth factorlike domain）、 CUB区、 CCP区（complement control protein domain）、 CCP区和SP区。初步研究表明, MASP1 N端的CUB和EGF区涉及与MBL CLR的结合3。为了深入研究MBL与MASP1结合的活性位点, 阐明MBL与MASP1相互作用从而激活凝集素途径的机制, 我们构建了MASP1N端片段（包括CUBEGFCUB区）的原核表达载体, 在大肠杆菌中高效表达MASP1N端蛋白。1 材料和方法1.1 材料 质粒pGEX4T1、 感受态大肠杆菌TOP10F和BL21(DE3)由本室保存。含人MASP1全长编码区cDNA的pGEMMASP1质粒、 重组人MBLCLR蛋白、 重组人MBL蛋白和抗人MBLCRD抗体由本室构建或制备4-6。限制性内切酶EcoR、 Xho, T4 DNA连接酶, Taq DNA聚合酶, dNTP, 低Mr蛋白Marker, DL 2000及HRP羊抗鼠IgG抗体均购自大连宝生物公司。PCR产物回收试剂盒, 小量DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒及小量质粒提取试剂盒均购自杭州维特洁公司。抗GST mAb购自北京TIANGEN公司。GSTrap亲和层析柱购自Amersham Biosciences公司。1.2 MASP1N端片段原核表达载体的构建 设计1对特异引物:上游引物序列为5GCGAATTCCACACCGTGGAGCTAAAC3, 含有EcoR酶切位点; 下游引物序列为 5GCCTCGAGCATTTCCTGCAGCCCTGTATG3, 含有Xho酶切位点。引物由上海博亚公司合成。以pGEMMASP1质粒为模板, 采用上述引物扩增MASP1N端包括2个CUB区和EGF区的编码基因片段（长度857 bp, 编码280个氨基酸）, 以PCR产物回收试剂盒回收扩增产物, 用EcoR和Xho双酶切MASP1N端基因片段和pGEX4T1质粒DNA, 10 g/L琼脂糖凝胶电泳, 凝胶回收试剂盒回收各片段, 以T4 DNA连接酶连接。连接产物转化感受态TOP10F大肠杆菌, 涂菌液于含100 mg/L 氨苄青霉素的LB平板中, 挑取单个菌落, 接种于含氨苄青霉素的LB培养液中, 37振荡培养12 h。提取质粒, 以限制性内切酶EcoR和Xho酶切鉴定, 并进行DNA序列测定（由上海博亚公司完成）。鉴定正确的质粒命名为pGEX4TMASP1N。1.3 重组蛋白的诱导表达 将鉴定正确的重组表达质粒pGEX4TMASP1N转化入BL21(DE3)感受态细胞中, 涂菌液于含100 mg/L氨苄青霉素的LB平板中, 挑取单个菌落, 接种于含同等浓度氨苄青霉素的LB培养液中, 37振荡培养过夜活化。按1%转种于同种培养液中, 37振荡培养至A600=0.61.0, 加入IPTG至终浓度为1 mmol/L, 诱导培养4 h。取1 mL菌液,制成蛋白电泳样品, 进行SDSPAGE鉴定。大量培养工程菌, IPTG诱导表达后, 离心收集菌体。用1/10培养液体积的缓冲液A（10 mmol/L imidazole, 300 mmol/L NaCl, 50 mmol/L NaH2PO4, pH8.0）悬浮沉淀细菌, 超声破碎, 10000 g离心10 min（4）, 分别收集上清和沉淀, 制样进行SDSPAGE分析。1.4 重组表达蛋白的复性与纯化 将收集的沉淀用预冷的5 mL/L TritonX100约30 mL洗涤2次, 每克菌约用6 mL 8 mol/L 尿素溶解, 4、 12000 r/min离心20 min。上清液用双蒸水进行梯度透析复性: 先于500 mL含8 mol/L尿素的溶液中4透析过夜, 然后分别在含5、 4、 3、 2、 1、 0.5 mol/L尿素的溶液中透析, 每6 h换液1次, 而后置于ddH2O中透析, 最后在PBS中透析过夜, 收集蛋白溶液经0.45 m滤膜过滤后上GSTrap层析柱, 使用AKATA Prime蛋白层析系统, 用Binding buffer（pH7.2, NaCl 140 mmol/L, KCl 2.7 mmol/L, Na2HPO4 10.1 mmol/L, KH2PO4 1.8 mmol/L）冲洗后, 用Elution buffer（50 mmol/L TrisHCl, 10 mmol/L 还原型谷胱甘肽, pH8.0）进行洗脱, 每次洗脱时的流速控制在1 mL/min, 收集各洗脱液, 取样进行SDSPAGE。1.5 重组蛋白的鉴定1.5.1 重组蛋白与抗GST mAb的结合 Western bolt分析: 纯化重组蛋白经SDSPAGE后电转移至硝酸纤维素膜上; 将膜置于含3 g/L脱脂奶粉的溶液中4封闭过夜, 然后加抗GST抗体, 37反应2 h; 洗膜后, 加15000 HRP羊抗鼠IgG, 37反应1 h; 洗膜后, 用DAB显色试剂盒显色。1.5.2 重组蛋白与MBLCLR的结合试验 洗涤液为含0.5 mL/L Tween20的0.15 mol/L、 pH7.4 PBS（PBST）, 稀释液（结合缓冲液）为含2.5 g/L BSA的PBST。将纯化重组蛋白从20 mg/L至0.6 mg/L倍比稀释, 以BL21(DE3)pGEX4T1表达蛋白作同样稀释作为阴性对照, 加入酶联板, 100 L/孔, 4过夜包被; 加入50 g/L脱脂奶粉, 37封闭2 h, 洗涤; 加入2 mg/L BiotinMBLCLR蛋白, 100 L/孔, 37作用1 h, 洗涤; 加12000稀释的HRPAvidin, 37反应1 h, 洗涤; 加入OPDH2O2底物液显色, 2 mol/L硫酸终止反应, 测定A490值。1.5.3 重组蛋白与重组人MBL的结合试验 包被和封闭方法同上, 洗涤; 加入0.5 mg/L的重组人MBL蛋白, 100 L/孔, 37作用1 h, 洗涤; 加入12000稀释的抗MBLCRD抗体, 37反应1 h, 洗涤; 加入15000稀释的羊抗小鼠抗体, 37反应1 h, 洗涤; 加入OPDH2O2底物液显色, 2 mol/L硫酸终止反应, 测定A490值。2 结果2.1 pGEX4TMASP1N重组表达载体的构建 使用特异引物对进行PCR, 从含人MASP1 cDNA的质粒pGEMMASP1中扩增得到约860 bp的目的基因片段, 将其插入pGEX4T1原核表达载体构建重组表达载体, 经EcoR和Xho双酶切, 只有第5泳道可见约4900 bp和860 bp条带, 前者为双酶切后的载体片段, 后者为双酶切后的目的DNA片段（图1）。DNA测序结果与预期的完全一致, 表明重组表达载体pGEX4TMASP1N构建成功。图1 重组质粒的鉴定（略）Fig 1 Identification of the recombinant plasmid1: DL 2000 DNA marker; 2-5: pGEX4TMASP1N/EcoR I+Xho I.2.2 重组蛋白在大肠杆菌中的表达 将鉴定正确的重组表达载体pGEX4TMASP1N转化大肠杆菌BL21(DE3), 37振荡培养过夜。按1%比例转种于同样培养液中, 37振荡培养至A600=0.61.0, 加入IPTG至终浓度为1 mmol/L, 诱导表达4 h。SDSPAGE分析表明, 与pGEX4T1/BL21(DE3)菌比较, 重组子pGEX4TMASP1N在Mr 60000处有1条较浓的蛋白带, 与预期的Mr相符。放大培养后收集细菌,超声破碎, 离心分离上清和沉淀, 分别进行SDSPAGE分析, 发现重组蛋白主要存在于沉淀中, 表明MASP1NGST融合蛋白为包涵体表达（图2）。图2 SDSPAGE分析重组表达产物（略）Fig 2 Analyses of the recombinant product by SDSPAGE1: Low molecular weight protein marker; 2: Total protein of pGEX4T1/BL21(DE3); 3: Ultrasound supernatant of pGEX4TMASP1N/BL21(DE3) before induction; 4: Ultrasound supernatant of pGEX4TMASP1N/BL21(DE3) after induction; 5: Ultrasound deposit of pGEX4TMASP1N/BL21(DE3) after induction.2.3 重组蛋白的纯化与鉴定 将收集的MASP1N BL21(DE3)菌体裂解液通过GSTrap层析柱纯化后, 进行SDSPAGE分析并用抗GST抗体对重组蛋白进行Western blot分析, 发现在Mr 60000处有条带（图3）。纯化的重组表达产物可与重组人MBLCLR蛋白结合, 也能和重组人MBL蛋白结合（图4）, 表明所获表达产物具有结合MBL的活性, 确实是MASP1N蛋白。图3 SDSPAGE和Western blot分析纯化重组表达产物（略）Fig 3 Analysis of the purified recombinant product by SDSPAGE and Western blot1: Low molecular weight protein marker; 2: Recombinant MASP1N/GST purified by GSTrap; 3: Western blot analysis of the recombinant MASP1N/GST purified by GSTrap.图4 MASP1N蛋白与重组人MBL及重组人MBLCLR蛋白的结合（略）Fig 4 Binding of MASP1N pritein to rhMBL and rhMBLCLR proteins3 讨论 人MASP1肽链包括6个结构域, N端的CUB区、 EGF区和CUB区, 随后是2个CCP区和C 端SP区。本实验中, 我们利用原核表达系统制备了人MASP1N蛋白, 包括N端2个CUB区和EGF区, 即成熟MASP2肽链的N端280个氨基酸残基。选用的pGEX4T1表达载体是一种融合表达质粒, 含有高效Ptac 启动子、 lacIq基因, 除了能表达外源蛋白外, 还可使谷胱苷肽转移酶（glutathiones transferase, GST）与外源蛋白融合表达从而增加表达产物的可溶性及产量。外源蛋白与GST蛋白的融合表达可以保护外源蛋白不易被降解, 外源蛋白与GST之间还具有肠激酶和凝血酶的识别位点, 可以方便的切下GST, 使表达的目的蛋白的构象及活性与天然蛋白更接近。我们将收集的工程菌体裂解液通过GSTrap柱纯化后, 进行SDSPAGE及Western blot分析, 发现有Mr约60000蛋白的表达, 此蛋白与MASP1N/GST融合蛋白Mr计算值相符。将重组表达产物纯化, 发现其能与重组的人MBLCLR和完整MBL蛋白结合, 表明所获表达产物确实具有MASP1结合MBL的活性。 在血浆中, 作为酶原的MASP与MBL分子结合形成复合体, 当MBL的CRD识别、 结合病原微生物的糖结构后, MASP酶原即活化, 从而激活补体凝集素途径而发挥天然抗感染免疫效应7。MASP1除能直接裂解C2外, 还具有凝血酶样作用, 可裂解合成肽底物中的精氨酸或赖氨酸残基所形成的肽键8, 裂解和激活凝血因子XIII和纤维蛋白原9。初步研究表明, N端的3个结构域即2个CUB区和1个EGF区是MASP1与MBLCLR结合的区域, 能以Ca2+依赖方式与MBL相互作用10, 11, 但这种相互作用的详细情况尚未明了。具有生物学活性的MASP1N蛋白的获得, 为进一步探索MBL的结构功能关系、 MBL与MASP相互作用的机制提供了实验材料。【参考文献】 1 Gadjeva M, Thiel S, Jensenius JC, et al. 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