《生物大分子的制备》PPT课件.ppt

生物大分子的制备技术 蛋白质、核酸的分离和提纯,研究生物大分子，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。 基本原理不外乎两方面： 一是利用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析、有机溶剂提取、层析和结晶等； 二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于不同区域而达到分离的目的 ，如电泳、超速离心、超滤等。,而在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、碱、高温及剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。 生物大分子的制备一般分为以下四个阶段： 选择材料和预处理； 细胞的破碎及细胞器的分离； 提取和纯化； 浓缩干燥和保存。,第一节 选择材料及预处理 选材：微生物、植物和动物都可作为制备生物大 分子的原材料，所选用的材料主要依据实验目的来确 定。 （一）微生物 微生物应该注意它的生长期，在微生物的对数生 长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量。,以微生物为材料时有两种情况 1、利用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等； 2、利用菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等。,（二）植物材料 植物材料必须经过去壳、脱脂并注意植物品种和生长发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。,（三）动物组织 动物组织用有效成分含量丰富的脏器组织为原料，先进行绞碎、脱脂等处理。另外，对于处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存。对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。,第二节 细胞的破碎及细胞器的分离 一、细胞的破碎 1、高速组织捣碎机捣碎 此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。,2.玻璃匀浆器匀浆 此法对细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用量少的动物内脏组织。,3.反复冻融法 将细胞在20以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 4.化学处理法 有些动物细胞，如：肿瘤细胞可采用十二烷基硫酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等使细胞膜破坏。如果细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好。,5、超声波处理 用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧振荡破碎。此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用菌体质量浓度为50100mg/ml ，在10100KHz频率下处理1015min 。此法的缺点是在处理过程中会产生大量的热能，应采取相应降温措施。对超声波敏感的酶和核酸应慎用。,细胞器名称 主要蛋白和酶 核 酸 细胞核 精蛋白、组蛋白、核酸合成酶系 全部的DNA和RNA10 线粒体 电子传递、氧化磷酸化、三羧酸循环、 微量DNA，总RNA 脂肪酸的氧化、氨基酸氧化等 510 内质网（微粒体）蛋白质合成酶系、羟化酶类 总RNA50 溶酶体 水解酶系（核酸酶、磷酸酯酶、 组织蛋白酶及糖苷酶） 高尔基体 糖苷转移酶、粘多糖类固醇合成酶 细胞膜 载体与受体蛋白、特异抗体、ATP酶、 环腺苷酶、葡萄糖6磷酸酶 细胞液 嘧啶与嘌呤代谢、氨基酸合成酶系、 RNA（主要是t RNA 可溶性蛋白类 占50）,二、细胞器的分离 各类生物大分子在细胞内的分布是不同的。一般采用差速离心法。,第三节 提取和纯化 提取是将经过处理或破碎的细胞，置于一定的条件和溶液中让被提取的生物大分子充分释放出来的过程。 影响提取的因素主要是被提取物质在提取的溶液中溶解度的大小及由固相扩散到液相的难易程度。某一物质在溶剂中溶解度大小与该物质的分子结构及溶剂理化性质有关，一般遵守相似相溶的原则。,一、蛋白质的提取（包括酶） 、pH 蛋白质和酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH应选择在偏离等电点两侧的pH范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化。从而导致蛋白构象的不可逆变化。一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液提取。,盐浓度 稀盐溶液可促进蛋白的溶解，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量Nacl等中性盐，一般以 0.15mol/L浓度为宜。缓冲液常采用0.02-0.05mol/L磷酸盐或碳酸盐的等渗盐溶液。,一、蛋白质的分离纯化 （一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法 1. 蛋白质的盐析 中性盐对蛋白质的溶解度有显著的影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度的升高，蛋白质的溶解度增加，称为盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称为盐析。,血浆蛋白质的分段盐析 硫酸铵的饱和度g . (100ml H2O )-1 沉淀的蛋白质 20 纤维蛋白 4833 r 球蛋白 4046 a 球蛋白 50 清蛋白 蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最多的是硫酸铵，它的优点是硫酸铵分段盐析效果也比其它盐好，不易引起蛋白质变性。,蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析。此外也可用葡聚糖凝胶G25或G50过柱的办法除盐，所用时间比较短。,2. 等电点沉淀法 蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的pH，达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结合使用。,3.有机溶剂提取法 （破坏水化膜和中和电荷） 一些和脂质结合比较的蛋白质和酶，它们不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中。这种情况可用乙醇、丙酮或丁醇等有机溶剂，它们具有较强的亲脂性，但必须在低温下操作。 丁醇提取法：一是因为丁醇亲脂性强，溶解磷脂的能力强；二是丁醇具有亲水性，在溶解度范围内不会引起酶的变性和失活。另外丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。,（二）根据蛋白质分子大小的差别分离方法 1.透析及超滤法 （利用蛋白质的大分子性质不能透过半透膜）,目 录,2. 凝胶过滤法,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,(三)根据蛋白质带电性质进行分离 蛋白质在不同pH环境中带电性质和电荷数量不同,可将其分开。 1.电泳法,目 录,带有NH3+,2.离子交换层析,二、核酸的提取 （一）DNA的提取 1. 组织细胞破碎后，加入0.5mol/LNacl溶液，离心去上清; 2.于沉淀中加1.0molNacl/L溶解; 3.然后用酚氯仿混合液振摇抽提。离心留取水相; 4.加入2倍体积的乙醇沉淀DNA; 5.DNA制品中的少量的RNA可用纯的RNase水解除去。,（二）RNA的提取 在提取RNA时最要紧的问题是防止RNase的降解。 常用的抑制措施有：低温4操作；所用器 皿高压消毒，试剂中加入RNase抑制剂；操作中戴 手套。 现在普遍通用的从动物组织和培养细胞中提取完 整的总RNA的方法是异硫氰酸胍法，它有很强的抑制 RNase活性的作用，使蛋白质变性效果也很好。,三、核酸的纯化 核酸的纯化最关键步骤是去除蛋白质。 通常只要用酚氯仿抽提核酸的水溶液即可。 四、核酸的浓缩 核酸浓缩应用最为广泛的是乙醇沉淀法。,五、DNA、RNA的定量 准确的方法是紫外分光光度法。用紫外分光光度计测定260nm 和280mn两个波长处的吸光度，然后，1A260=50ugml双链DNA 1A260=40ugml单链DNA或RNA 260nm和280nm两处读数的比值（A260A280），可反映核酸的纯度。DNA和RNA纯品的吸光度比值分别是1.8和2.0 。如果样品中有蛋白质或酚的污染，则两者比值将明显降低。,第四节 浓缩、干燥及保存 一、样品的浓缩 为了保存和鉴定的目的，往往需要进行浓缩。 1.减压加温蒸发浓缩 该方法通过降低液面压力使液体沸点降低，加压的真空度愈高，液体沸点降的愈低，蒸发愈快。此法适用于一些不耐热的生物大分子的浓缩。,2.空气流动蒸发浓缩 空气的流动可使液体加速蒸发，将铺成薄层的溶液，表面不断通过空气流。此法浓缩速度慢，不适于大量溶液的浓缩。 3.冰冻法 溶剂在低温下结成冰，盐类及生物大分子不进入冰内而留在液相中。 4.超滤法 5.吸收法 所用的吸收剂必须与溶液不起化学反应，对生物大分子不吸附，易与溶液分开。常用的吸收剂有聚乙二醇、蔗糖等。,二、干 燥 干燥(drying)是将潮湿的固体、膏状物、浓缩液及液体中的水或溶剂除尽的过程。 1.真空干燥适用于不耐高温，易于氧化的物质干燥。整个装置包括干燥器、冷凝器及真空泵三部分。干燥器内常放一些干燥剂，如五氧化二磷、无水氯化钙等。 2.气流干燥,三、保 存 只要将干燥的样品置于干燥器内（内装有干燥剂）密封，保存在04冰箱内即可；液态储存也有其优点，首先免去繁杂的干燥过程，生物大分子的活性和结构破坏较少，但液态储存时应注意以下几点：,1. 样品不能太稀，必须浓缩到一定浓度才能封装储存，样品太稀易使生物大分子变性。 2. 一般需加入防腐剂和稳定剂，常用的防腐剂有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。此外，钙、锌、硼酸等溶液对某些酶也有一定保护作用。核酸大分子一般保存在氯化钠或柠檬酸钠的标准缓冲液中。 3. 储存温度要低，大多数在0左右冰箱保存，有的则要求更低，应视不同物质而定。,实 验 碱性磷酸酶的分离与纯化 磷酸苯二钠法,酶的分离和纯化 基本原则：提取过程中避免酶变性而失去活性 目的：一是把酶制剂从很大体积浓缩到比较小的体积；二是把酶制剂中大量的杂质蛋白和其他大分子物质分离出去。 衡量指标：总活力的的回收；二是比活力提高的倍数。,表示提纯过程中酶的损失情况,表示提纯方法的有效程度,一、目的 1掌握碱性磷酸酶分离纯化的实验方法。 2掌握酶活性测定的一般实验方法。 二. 原理： 碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,AKP 或 ALP ）是一种底物特异性较低，在碱性环境中能水解多种磷酸单酯化合物的酶，需要镁和锰离子为激活剂。,本实验采取有机溶剂沉淀法从肝匀浆液中提取分离碱性磷酸酶(AKP)，根据用30乙醇、33丙酮提取时，ALP溶于30乙醇、33丙酮，离心后弃沉淀以除去杂质和杂蛋白，再将ALP用60乙醇、50丙酮提取时，ALP不溶于60乙醇、50丙酮，离心后弃上清除去杂质和杂蛋白，获得较纯的碱性磷酸酶。,ALP活性测定采用磷酸苯二钠法,碱性磷酸酶酶蛋白含量测定采用 Marion M bradford 法，利用考马斯亮蓝与蛋白着色，(考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。)在一定程度范围内蛋白质含量与颜色深浅成正比，最后根据测得的酶蛋白毫克数及酶活性单位数计算出比活性，鉴定酶的纯化程度。,三、操 作 （一）分离纯化 1.匀浆 称取新鲜兔肝2g，剪碎后置于玻璃匀浆器中加入0.01mol/L醋酸钠(低渗破膜作用)及醋酸镁(有保护和稳定AKP的作用)混合液6ml，在电动匀浆器中匀浆34min ，匀浆液倒入刻度离心管中，记录体积A液。取0.1ml与另一试管中，加4.9ml pH 8.8 Tris醋酸镁缓冲液稀释,作为A液待测比活性。 2.提取 加2ml正丁醇(可使部分杂蛋白变性，释出膜中酶，过滤后，以去除杂蛋白) 于A液中,用玻棒充分搅拌2min ,室温放置30min ,单层纱布过滤,滤液置于刻度离心管中。,3.丙酮沉淀 滤液中加入等体积的冷丙酮,立刻混匀后离心3,000r/5min。离心后将上清液倒弃,在沉淀中加入0.5mol/L醋酸镁4ml, 用玻棒充分搅拌使其溶解,同时记录悬液体积(B液)。 取0.1ml于另一试管中,加入4.9ml pH 8.8 Tris醋酸镁缓冲液混匀,作为B液待测比活性。,4.分步分离 于混悬的悬液中加入冷95%乙醇 ,使乙醇最终体积分数达30 ,混匀后立即离心2000 r/min ,5min ,离心后将上清液倒入另一离心管中,弃沉淀 ；,在上清液中加入冷95%乙醇 ,使乙醇最终体积分数达到60% ,混匀后离心3000r/min ,5min ,将上清液倒弃,于沉淀中加入0.01mol/L 醋酸镁及醋酸钠混合液4ml,充分搅拌 ,使其完全混悬。,5.重复上述操作 在悬液中加入冷95%乙醇 ,使乙醇最终体积分数达30 ,混匀后立即离心2000 r/min ,5min ,离心后将上清液倒入另一离心管中 ,弃沉淀 ；在上清液中加入冷95%乙醇 ,使乙醇最终体积分数达到60% ,混匀后离心3000r/min ,5min ,将上清液倒弃,于沉淀中加入0.5mol/L 醋酸镁3ml充分混悬,并记录体积(C液),取0.1ml加入另一试管中,加pH 8.8 Tris醋酸镁缓冲液0.9ml混匀,作为C液待测比活性。,6.其余悬液中加入丙酮,使丙酮终体积分数为33%,混于后离心2000 r/min ,5min ,弃沉淀,于上清液中加入冷丙酮 ,使丙酮终体积分数达到50%。混匀后离心3000r/min ,15min ,离心后弃上清液,于沉淀中加入pH 8.8 Tris醋酸镁缓冲液5ml,混匀后离心3000r/min ,5min ,上清液即为纯化酶液 ,作为D液用于比活性.,(二) 碱性磷酸酶的活性测定(磷酸苯二钠法) 1.取试管6只编号 ,按下表操作 管号 A B C D 标准 空白 各阶段稀释酶液/ml 0.1 0.1 0.1 0.1 酶标准液(0.1mg/ml) /ml 0.1 pH 8.8 Tris醋酸镁 缓冲液/ml 0.1 预热至37复合底物 液/ml 3.0 3.0 3.0 3,0 3.0 3.0 立即混匀 37水浴中保温15min ,保温结束后,各管加入0.5%铁氰化钾2ml终止反应。静置15分钟,显色后510nm波长比色。,2. 酶活性单位计算: 37保温15min,产生1mg酚,为1个酶活性单位.故每毫升酶液中的酶活性单位为: （三）碱性磷酸酶酶蛋白含量测定 1.取试管6只编号,按下表操作:,碱性