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2011艾滋病基础技术培训,济南市CDC 潘晶,什么是艾滋病病毒（HIV）,HIV属于逆转录病毒科，慢病毒亚科，单链双拷贝RNA病毒。 病毒颗粒：呈20面体立体对称球形，表面有刺突状结构的糖蛋白，分为包膜和核心两部分,艾滋病的传播途径,经血液传播：输血、静脉吸毒等。 经性传播：异性、同性、双性。 垂直传播：母婴经胎盘传播。,艾滋病的检测方法,快速检测：胶体金/硒、明胶凝集、唾液检测卡等。 敏感性约相当于中度敏感的ELISA，适用于应急检测、门诊急诊个体检测。 优点：简单、快速。 缺点：不稳定、假阴/阳性 常用筛查实验：酶联免疫（ELISA）、化学发光等。 确证检测：免疫印迹实验（WB） 其他检测方法：核酸检测等,什么是ELISA方法,是以酶标记的抗体或抗原为主要试剂，利用抗原抗体反应进行的检测方法,是标记免疫技术的一种。,目前使用的ELISA试剂多为第三代及第四代ELISA试剂。 第四代试剂是最近发展起来的HIV抗原抗体联合测定试剂，可同时检测P24抗原和抗HIV-1/2抗体。与第三代抗HIV-1/2试剂相比，检出时间提前了4-9.1天，其优点在于能同时检测抗原、抗体，降低血源筛查的残余危险度。,什么是ELISA方法,什么是ELISA方法,什么是ELISA方法,ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂： 固相的抗原或抗体， 酶标记的抗原或抗体， 酶作用的底物，根据试剂的来源和标本的性状以及检测的条件，可设计出各种不同的检测方法。,ELISA的成品试剂盒中包含以下各组分： (1)已包被抗原或抗体的固相载体(96孔板); (2)酶标记的抗原或抗体(结合物); (3)酶的底物（缓冲液和底物液或称A/B液）; (4)阴性对照品和阳性对照品(定性测定中) (5)有些试剂盒中还有标本的稀释液; (6)洗涤液（基本为通用的浓缩磷酸盐溶液）; (7)酶反应终止液（一般为弱硫酸液）,什么是ELISA方法,必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、批批检验合格、在有效期内的试剂。推荐使用经临床质量评估敏感性和特异性高的试剂。,什么是ELISA方法,1 HIV抗体检测可用于监测、诊断、血液筛查。 2 以监测为目的的检测是为了解不同人群HIV感染率及其变化趋势而进行的检测，检测的人群包括各类高危人群和一般人群。 3 以诊断为目的的检测是为了确定个体HIV感染状况而进行的检测，包括临床检测和自愿咨询检测、术前检测、根据特殊需要进行的体检等。 4 以血液筛查为目的的检测是为了防止输血传播HIV而进行的检测，包括献血员筛查和原料血浆筛查。,HIV抗体检测的目的,HIV检测试验流程,最常用的样品是血液，包括血清、血浆和全血。唾液或尿液有时也可作为测试样品。 什么是血清：抽取静脉血，置于普通试管内，室温下自然放置12h，待血液凝固、血块收缩后再用3000r/min离心15min，吸出血清备用。 什么是血桨：抗凝静脉血，抽取静脉血后，置于加有EDTA或肝素等抗凝剂的试管，颠倒混匀数次，可用于CD4细胞检测。离心分离出的上清液为血桨。 血浆与血清的区别是上清液中存在纤维蛋白，容易产生假阳性。因此尽量上送血清样品。,采样,注意：采血时自我防护，使用安全针具，戴双层手套,用于抗体检测的血清或血浆样品，应存放于-20以下，短期（1周）内进行检测的样品可存放于2-8。 用于CD4+/CD8+T淋巴细胞测定的样品不能长期保存，样品采集时间超过48h则不可检测。,采样,血液样本应及时检测，一般10个工作日内必须出具报告。 各筛查实验室必须对样品进行ELISA或化学发光法检测。不能只进行快速检测。 对于筛查阴性的样品出具： “HIV抗体阴性（）”报告,此为唯一正确格式,检测及报告,实验室间传递的样品应为血清或血浆，除特殊情况外一般不运送全血。 应采用三级包装系统（WHO提出） NO.1 带螺帽的冻存管，要求防渗漏。 标注：姓名、种类以及采集时间。,疑似阳性样品的处理,试管的周围应垫有缓冲吸水材料（泡沫塑料等）。,NO.2 ：要求耐受性好、防渗漏、容纳并保护第一层容器，带盖子。（金属盒，硬塑料盒） NO.3：生物运输箱。外贴警示标签。,疑似阳性样品的处理,随样品应附有送检单，送检单应与样品分开放置， 并由1名检验人员和1名具有中级以上技术职称的人员的手写签字。,血清和血浆样品应在28条件下由专人运送。用于CD4+/CD8+T淋巴细胞测定的样品应在室温下1825运送。,疑似阳性样品的处理,运送必须有阳性标本转运登记表：送样人以及接收人都要有签字。,实验室需要重视的问题：cutoff值的计算,临界值（cutoff值）是界定样品阴阳性的标准，不同的试剂有不同的设定方法。 以珠海丽珠为例： cutoff值=NC1+0.15。 （阴性对照0.08，按0.08计算） 因此在NC10.08时，cutoff值=0.230.,S/CO值的计算： S/CO值=样品OD值/cutoff值 S/CO值1为阳性，反之为阴性。,实验室需要重视的问题：cutoff值的计算,HIV检测一般不设灰度值，遇到临界的情况需重新检测并咨询上级检测单位。,外部质控目的： 为了监控检测的重复性和稳定性， 试剂盒批间或孔间差异。 包括强阳性、弱阳性和阴性对照血清。也可以只设置一个弱阳性对照，以该试剂盒临界值（cutoff值）的23倍为宜。,实验室需要重视的问题：外部质控的设定,外质控品可通过购买获得，不能使用试剂盒中的阴/阳性对照配制。 按一周实验用量分装、分类、标记、封口、-20冻存于非自动除霜冰箱中。 不可反复冻融，一旦融化后应该存放28，一周内用完。,实验室需要重视的问题：外部质控的设定,60/110l 阳性血清,60/110l 阴性血清,60/110l 阴性血清,60/110l 阴性血清,60/110l 阴性血清,60/110l 阴性血清,60/110l 阴性血清,质控品梯度稀释方法,将梯度稀释后的样品同普通样品一样进行OD值测定,60/110l 混合液,对于检测量小的单位，可以使用“即刻法”进行质量控制。 对于检测量大的单位，可以使用常规方法（L-J法）进行质量控制。,实验室需要重视的问题：质控方法的种类,“即刻法”质控是在对同一批外部质控血清（Q）进行连续测定3次后，即可对第3次检验结果进行质控。一直到20次后更换为“L-J法质控”为止。 具体计算方法如下：,即刻法质控,将质控血清的测定值从小到大 排列： x1，x2，x3xn (x1为最小值，xn为最大值)。 计算平均值 和标准差s。,即刻法质控,计算SI上限值 和SI下限值。 将SI上限、SI下限与“SI值表”中的数字比较。,即刻法质控,即刻法质控,（4）当SI上限值和SI下限值 n3s时说明该值已在3s范围之外，属“失控”。,每增加一个测定值都要重新计算平均值和标准差，重复以上各项计算。,即刻法质控,（7）数值处于“告警”和“失控”状态应舍去，需重新测定该质控血清和病人样品。 （8）舍去的只是失控的这次数值，其它测定值仍可继续使用。,即刻法质控,最常用的质控图是Levey-Jennings质控图，通过图形分析可提供一段时间内实验室质量控制的总体情况。,Levey-Jennings质控,质控图参数包括： 算数平均值： 标准差: 是描述样品与均数之间离散 程度的一个指标。 S 变异系数：用来衡量检测的重复性。CV 经由“即刻法”质控后得到了20个Q的数据作为基础数据计算得出各项参数值。,L-J法质控,绘制质控图:包含一条中心横线（均值线） 和其上、下各两条平行的控制线（均值1SD和均值 2SD），并按时间顺序点入本实验室每次试验Q的测定值。,L-J法质控,将平均值和标准差分别在质控框架图中标示出来。以S/CO值作纵座标(Y轴)，每一次试验时间点作为横座标(x轴)，绘制质控图。,L-J法质控,从第21次的Q值起，将每次质控血清的检测结果依次点入该质控框架图中，检验进入质控状态。,L-J法质控,前20次数据属于即刻法，在L-J法中成为基础数据不标入图中,告警（2S）：当外部对照的S/CO值超出2s范围时，系统处于告警状态，应予注意，是否可以继续检测需要进一步观察。 失控（3S）：当外部对照的S/CO值超出3s范围时，系统处于失控状态，本次实验结果不能被接受。 可能是系统误差、随机误差或外部对照滴度下降造成。 超出2s或3s的数据不应删除,L-J法质控,位移：连续几次（35次）外部对照S/CO值都落在均值的一侧则称为位移，提示实验条件发生了较大的变化。 趋势：连续几次（57次）外部对照S/CO值几乎按一个方向分布时称为趋势，通常由参数的缓慢改变引起。,L-J法质控,更换了新的试剂盒孵育时间和温度不准确更换新的检验人员 更换了新的仪器设备（加样器、洗板机、酶标仪等）,出现下列情况时，应暂停检测查找原因 出现一次3s范围的变化 连续两次出现同一方向2s范围的变化 连续四次出现同一方向的1s范围的变化 连续10次结果都在1s范围内，但落在 均值线的同一侧。,L-J法质控,实验室应建立质控图分析及失控情况处理程序。 当出现失控时必须找出问题原因，并找出解除故障的方法，消除原因，防止将来出现同样的问题。,L-J法质控,建议长期和稳定地使用一种质量好的试剂盒，更换不同厂家的试剂盒后，必须重新配制质控品并重新进行新的质控，绘制新的质控图。并在质控图上注明使用日期。,L-J法质控,发现质控结果失控，应填写报告单，上交质量负责人，分析原因并决定是否发出检测报告。 质控图上必须有操作者以及审核者的手写签名。,L-J法质控,使用新批次的外部对照质控物时，必须重新绘制质控图。变异系数(cv)小于20，表示外部对照处于稳定状态。,L-J法质控,实验室操作人员在实验室内必须穿戴规范的防护用品，隔离衣、口罩、帽子等。 HIV病毒对酒精等化学消毒剂敏感，实验室内应备有酒精喷壶等设备。 实验室废弃物必须用高压蒸汽灭菌后，装入黄色垃圾袋中，并贴上警示标签后。由专人负责转运。并填写废弃物转运登记。,实验室需要重视的问题： 生物安全及废弃物处理,仪器鉴定是确保整个实验顺利进行的重要条件之一，是必须具备的。 仪器鉴定要提前进行，以防止仪器使用中出现鉴定过期现象。 仪器的鉴定管理最好有专人负责管理。,实验室需要重视的问题：仪器检定,济南市规定每月5日之前报上个月的报表。 每个月的报表的纸质版记录都需要保存。 阳性结果上报必须以收到确认阳性报告的时间为准，不可擅自上报。 工作量为“0”也要上报。,实验室需要重视的问题：实验室月报,济南市HIV确证实验室介绍：外观,艾滋病检测实验室需要相对独立的实验房间。 实验室门口必须贴有黄色的生物安全警示标志。,在实验室的清洁区域放置打印机以及各种登记用的文档。 在清洁区内及时完成各种实验记录的书写工作。,济南市HIV确证实验室介绍：布局,在实验室的污染区内完成各项实验。 实验必须在生物安全柜内进行。 实验人员必须穿着防护服，带口罩、帽子、双层手套。,济南市HIV确证实验室介绍：试验操作,实验室内放置温湿度仪，监控环境温度在18-25。 酶标仪放置在污染区，与清洁区的打印机相连接。,济南市HIV确证实验室介绍：布局,实验室的