中药材鉴别技术交201311课件

中药材鉴别检测技术 及残留相关要求,成都中医药大学 李敏 028 2013年11月 成都,主讲内容,（一）制假特点,一、中药材违法制假情况及检测方法分析,高科技、高水平、高利润（暴利）,（二）具体表现,掺假使假品种增加； 制、售假药的区域扩大； 制假手段、水平高，真假难辨； 贵细、濒危药材成为目前制假的主流。,（三）制假手段,仿真制作；增加重量；染色掺假；提取有效成分。,1、仿真制作,（1）利用一些外观形状和颜色相近的动植物进行制假掺假 如被称为“万能假药”的牛蒡子根加工成升麻、人参、丹参；小天南星加工成半夏；炒后的葶苈子或党参籽充当车前子等。,一、中药材违法制假情况及检测方法分析,1、仿真制作,（2）采用与原药材无关的原料经手工或机器加工出与药材外形相似的假药,如用聚乙烯加工成假羚羊角、假穿山甲；用动物皮毛包裹填充物制成假麝香、假鹿茸；用面粉、石膏等加工模压成假冬虫夏草。,蛤蟆油,羚羊角及其塑料加工品,明胶蛤蟆油,一、中药材违法制假情况及检测方法分析,鉴别方法：经验鉴别、显微鉴别、理化鉴别,（2）质地疏松的药材增重 在中药材或饮片中渗入硫酸镁（重金粉）、白矾、明矾、硼砂等无机盐或在表面喷洒明矾、滑石粉等物质。如黄连、通草、桑白皮、远志、川断、升麻、苍术、北沙参、山药、粉葛、金银花、红花、芫花等。,一、中药材违法制假情况及检测方法分析,2、增加重量,（3）质地紧密的药材增重 在质地紧密的中药材或中药饮片表面涂布或喷洒琼脂、明胶、石灰粉等胶状物。如:赤芍、白芍、白芷、乌药、西洋参片、天麻片等均发现用此方法人为加重，有些僵蚕表面裹有大量胶水。,西洋参明胶掺假,明 胶,僵蚕石灰粉掺伪,一、中药材违法制假情况及检测方法分析,2、增加重量,增重鉴别方法：,2、增加重量,一、中药材违法制假情况及检测方法分析,共性鉴别：性状鉴别、总灰分检查、镁盐及铝盐检查（水浸液，加浓氨水2滴，溶液不得出现明显浑浊。）,3、染色掺假,(1)中药材掺假染色的主要方式和品种,造假染色：西红花、血竭、朱砂等 增重掺假染色：红花、冬虫夏草、青黛等 劣质药材染色：五味子、蒲黄、延胡索等 提取成分后染色：黄芩、姜黄、川乌等,一、中药材违法制假情况及检测方法分析,染黄人工牛黄、蒲黄、黄芩、姜黄、延胡索； 染红红花、五味子、朱砂、血竭、鹿角； 染黑冬虫夏草、水蛭、制川乌、制草乌、制首乌、胆南星； 染蓝青黛；,非法染色,（2）已发现的掺假染色中药材品种及其色素,常用于中药材、中药饮片的染色惨假的化工色素有金胺O、金橙（酸性橙 ）、胭脂红、柠檬黄等。由于它们多数为非食用色素，特别是金胺O、金橙为可疑致癌物，对人体健康危害大，应注意鉴别。,（3）中药材掺假染色检测的技术方法,中药材中黄色、橙黄色化工染料或色素的检测方法 中药材蒲黄、黄芩、黄连、黄柏、延胡索、姜黄等易被金胺O、金橙、碱性橙、柠檬黄、亮黄、日落黄等6种黄（橙）色染料和色素染色。,黄连、黄柏：、蒲黄、黄芩、延胡索中染色色素的检查： 薄层色谱鉴别：以金胺O为对照品进行薄层色谱鉴别，在与对照品色谱相同位置不得检出相同颜色的黄色斑点； 高效液相色谱法验证：不得出现与对照试剂色谱保留时间相同的色谱峰。 必要时可采用高效液相色谱-质谱连用方法进一步验证。,示例4 蒲黄染色掺伪的鉴别,一、中药材违法制假情况及检测方法分析,（3）中药材掺假染色检测的技术方法,中药材中红色（含部分黄、橙色）化工染料或色素的检测方法 中药材血竭、朱砂、西红花、红花、五味子、茜草等易被柠檬黄、胭脂红、苋菜红、赤藓红、酸性红73、金胺O、金橙、新品红、 808猩红、苏丹红、苏丹红等11种红色色素染色。,示例5 红花染色掺伪的鉴别 示例6 五味子染色掺伪的鉴别 示例7 人工牛黄染色掺伪的鉴别 示例8 血竭染色掺伪的鉴别,一、中药材违法制假情况及检测方法分析,（3）中药材掺假染色检测的技术方法,中药材中水溶性色素的检测方法 中药材冬虫夏草、乌梅、水蛭、全蝎、枸杞子、山茱萸等易被柠檬黄、胭脂红、苋菜红、日落黄、赤藓红、亮蓝、诱惑红等7种水溶性食用色素染色。,冬虫夏草色素检查： 薄层色谱鉴别：以胭脂红、苋菜红、日落黄、亮蓝为对照品进行薄层鉴别，在与对照品色谱相同位置不得检出相同颜色的斑点； 高效液相色谱法验证：不得出现与上述对照试剂色谱主峰保留时间相同的色谱峰。 乌梅色素检查： 薄层色谱鉴别：以苋菜红、日落黄、亮蓝对照品进行薄层鉴别，在与对照品色谱相同位置不得检出相同颜色的斑点； 高效液相色谱法验证：不得出现与上述对照试剂色谱主峰保留时间相同的色谱峰。,必要时可采用高效液相色谱-质谱连用方法进一步验证。,示例9 正品冬虫夏草与古尼虫草的鉴别 示例10 乌梅染色掺伪的鉴别 示例11 青黛染色掺假的鉴别,一、中药材违法制假情况及检测方法分析,中药材掺假染色检测的技术方法,经验鉴别、理化鉴别快速筛查 薄层色谱法定性鉴别、常规检测 高效液相色谱法定性鉴别、常规检测 液-质联用法结构鉴定、方法验证,4、提取有效成分,很多中药提取成分后，外观性状未被破坏，又被返回市场重新销售，或掺入未提取药材中出售，极难发现。如大部分果实种子类及根及根茎类药材。,一、中药材违法制假情况及检测方法分析,中药材违法制假检测方法,中药材违法制假检测方法,基原 性状显微 理化,生物鉴定,免疫鉴定法、电泳鉴别法及DNA分子标记等,光谱检测鉴定,如紫外、红外、荧光、原子吸收及质谱等,先进仪器设备及技术,如核磁共振波谱、扫描电镜、生物芯片等,一、中药材违法制假情况及检测方法分析,二、DNA分子技术在中药鉴定方面的应用,1、DNA分子标记的类型,分 子 标 记,以电泳技术和分子杂交为基础的DNA标记技术（RFLP标记-限制性片段长度多态性）,以电泳技术和PCR技术为核心的DNA标记技术 （RAPD标记-随机扩增的DNA多态性、 AFLP标记-扩增片段长度多态性、 SSR标记、SSLP标记、SCAR标记 、STS标记 ）,以测序为基础的新型的分子标记（SNP标记、EST标记） 及基因芯片等,2、DNA分子标记的特点,二、DNA分子技术在中药鉴定方面的应用,二、DNA分子技术在中药鉴定方面的应用,3、应用示例1近缘种之间的鉴定,对红豆蔻及其混淆品（节鞭山姜、华山姜、假益智、多花山姜）的nrDNA ITS区序列进行分析，成对比较时差异较大，可准确鉴定中药红豆蔻及其混淆品。 人参与西洋参及其他混伪品的DNA分子鉴定。 如甘草药用资源的整理与鉴定，采用RAPD分子标记方法比较4种甘草属植物光果甘草、乌拉尔甘草、刺甘草和刺果甘草的遗传关系。通过DNA扩增的RAPD指纹图谱分析，结果发现富含甘草甜素的光果甘草和乌拉尔甘草之间遗传关系非常相近。这两者与不含甘草甜素或含量极低的刺甘草和刺果甘草的遗传关系则较远，与植物分类学研究相吻合。 方法：总DNA提取构建富含SSR的文库文库筛选SSR特异性引物的设计PCR扩增多态性分析,3、应用示例2中药野生品与栽培品（养殖）的鉴定,如利用简单序列重复(SSR)分子标记可以有效鉴定不同天麻居群（红天麻、乌天麻及黄天麻）的野生和栽培品种，并且利用相应引物均能很好地区分野生天麻、无性繁殖天麻及有性繁殖天麻，其中有性繁殖天麻均扩增出2条带，为杂合子；野生天麻及无性繁殖天麻只扩增出1条带，为纯合子。,二、DNA分子技术在中药鉴定方面的应用,3、应用示例3道地性研究,二、DNA分子技术在中药鉴定方面的应用,当归为伞形科植物当归Angelica sinensis( Oliv.)Diels的干燥根，自古以来以甘肃崛县一带为道地产区，所产当归药材质量最佳，习称“岷归”。 应用RAPD技术对不同产地的当归样品进行分析，通过10个引物在每个样品中获得平均为55个的DNA片段，在此基础上构建18个不同产地当归样品的聚类树状图。进一步的分析表明，地理分布距离越小，当归的遗传差异越小；反之，越大；并且生态环境特别是小生境对当归遗传差异的作用不可忽视。因此药材的道地性不仅是一个地理意义上的概念，同时具有广泛的生物学内涵以及丰富的遗传特性。 应用ISSR指纹标记技术对来自广西、广东、贵州、云南等省区的铁皮石斛的8个居群进行DNA分子鉴别研究，扩增得到127个条带，其中多态性条带115个，仅有2个引物产生的6个特异性条带可作为铁皮石斛8个居群鉴定的分子标记，由此建立了有效鉴定对铁皮石斛居群的ISSR指纹技术,3、应用示例4动物类中药的鉴定、 名贵药材与混伪品的鉴定,蕲蛇的鉴定： 采用聚合酶链式反应法（PCR），以5GGCAATTCACTACACAGCCAACATCAACT3和5CCATAGTCAGGTGGTTAGTGATAC3为引物，供试品凝胶电泳图谱中，在与对照药材凝胶电泳图谱相应的位置上，在200300bp应有单一DNA条带。 乌梢蛇的鉴定： 采用聚合酶链式反应法（PCR），以5GCGAAAGCTCGACCTAGCGAAGGGGACCACA3、5CAGGCTCCTCTAGGTTGTTATGGGGTACCG3为引物，供试品凝胶电泳图谱中，在与对照药材凝胶电泳图谱相应的位置上，在300400bp应有单一DNA条带。,二、DNA分子技术在中药鉴定方面的应用,3、应用示例5其他,除上述应用外，DNA分子标记技术也常被用于中药材种质资源的评价、中药原植物进化及分类研究、中药材品种选育等方面。,二、DNA分子技术在中药鉴定方面的应用,1、中药性状鉴别的特点,三、中药材外观鉴别和检验检测技术,中药材外观鉴别，即性状鉴别，是长期以来人们对中药真伪优劣鉴别实践的高度总结,主要根据中药的外观属性(形、色、气、味)，利用感官系统，即看、摸、闻、尝等方法，必要时辅以水试、火试达到鉴定中药材目的。 方法：眼看、手摸、鼻闻、口尝、水试、火试 内容：形状、大小、色泽、表面特征、质地、断面特征、气、味、水试、火试等十个方面。 特点：简单、易行、迅速。,辨状论质,2、中药性状鉴别的内容,三、中药材外观鉴别和检验检测技术,三、中药材外观鉴别和检验检测技术,2、中药性状鉴别的内容,三、中药材外观鉴别和检验检测技术,三、中药材外观鉴别和检验检测技术,四、二氧化硫残留量限量标准,测定方法： 中国药典2010年版第二增补本规定使用蒸馏法测定：,限量要求： 党参、山药、牛膝、粉葛、天冬、天麻、天花粉、白及、白芍、白术等10种中药材及其饮片中二氧化硫残留量不得超过400 mg/kg 其他中药材及其饮片的二氧化硫残留量不得超过150mg/kg,43味药材各部分所占比例,重金属超标比例,镉所占比例最大，达到65%，其次分别是铅、铜、砷和汞。,五、重金属等残留限量标准,重金属超标的现状,五、重金属等残留限量标准,重金属的限量及检测方法,五、重金属等残留限量标准,测定了45种药材共80批样品 80批样品中共55批药材检出农药，农药检出率：69 每种不同的药材的农药残留品种不尽相同，共涉及检出中农药58种 检出率最高的农药为：多菌灵、啶虫脒、噻嗪酮、三唑磷、克百威 最多的一批药材(陈皮)检出17种农药 多批药材（黄芩、菊花、佛手、陈皮、天花粉、白花蛇舌草及薏苡仁）检出10种以上农药 说明滥用农药现象较为严重,农药残留超标的现状,甘草、黄芪中六六六(总BHC)不得过千万分之二；滴滴涕(总DDT)不得过千万分之二；五氯硝基苯(PCNB)不得过千万分之一 人参茎叶总皂苷、人参总皂苷中六六六(总BHC)不得过千万分之一；滴滴涕(总DDT)不得过百万分之一；五氯硝基苯(PCNB)不得过千万分之一,中国药典2010年版一部规定使用GCECD法测定：,五、重金属等残留限量标准,中药中的外源性有害物质主要是农药残留、重金属及其有害元素、黄曲霉毒素和二氧化硫等。,中药材外源性有害物质残留限量及检测,农药残留的限量及检测,中药中残留的农药主要有有机氯农药、有机磷农药和拟除虫菊酯类农药。中国药典2010年版采用气相色谱法检测中药中残留的农药。,有机氯农药残留量的检测： 用GC-ECD法测定中药中3类共9种有机氯农药的残留量，并规定了一些药材的有机氯农药限量。,中药材外源性有害物质残留限量及检测,农药残留的限量及检测,有机磷农药残留量的检测：有机磷农药常见的有敌敌畏、对硫磷、乐果、二嗪农、久效磷等12种。 拟除虫菊酯类农药残留量的测定 ：中国药典2010年版一部规定使用气相色谱法检测氯氰菊酯、氰戊菊酯及溴氰菊酯在中药中的残留量。,中药材外源性有害物质残留限量及检测,黄曲霉毒素的限量及检测,测定方法：中国药典2010年版一部规定用高效液相色谱法测定药材、饮片及制剂中黄曲霉毒素（以黄曲霉毒素B1、B2和G1、G2 总量计）。 中国药典2010年版规定陈皮、桃仁、酸枣仁、胖大海、僵蚕中每1000g含黄曲霉毒素B1不得过5g，含黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素B2和黄曲霉毒素B1的总量不得过10g。,六、原子吸收法基本原理及相关要求,原子吸收光谱法又称原子吸收分光光度法，该方法基于被测元素基态原子在蒸气状态下对特征电磁辐射吸收而进行元素定量分析的方法。 原子吸收法目前主要用于测定中药和中药制剂中的重金属及有害元素、微量元素的含量测定，对于含有动、植物成分的中药药物，一般需要先将其消化，破坏有机体后再进行测定。该法具有专属性强，检测灵敏度和精密度高，测定快速等特点。,六、原子吸收法基本原理及相关要求,1、基本原理