残次龙须菜多糖的降解及降解产物活性的研究.ppt

2009-2010年度汇报 残次龙须菜化学降解及降解产物活性研究,汇报人：杨拉维 指导老师：陈美珍,2011-5-21,报告内容,一 研究技术路线 1 正交实验优化提取工艺 2 化学法降解条件的优化和选择 3 测定降解产物的分子量和化学组成 4 抗氧化活性 降血糖活性 三 小结,研究背景及意义,龙须菜的每年种植量不断增加，主要用于提取琼胶，大量的活性多糖没有得到合理的利用，严重影响龙须菜的种植。每年大量的残次龙须菜被废弃，污染环境。 采用降解的方法降解琼胶，产生小分子量的活性多糖，并研究降解产物的结构和抗氧化活性，探索降解的作用机制，不仅为龙须菜的综合利用以及龙须菜多糖保健品的开发提供实验技术和理论依据，而且能解决环境污染问题。,研究方案及研究技术路线,残次龙须菜,设计正交实验优化多糖提取工艺,测定不同降解产物的分子量和组成,抗氧化活性 降血糖活性,多糖的分离纯化及纯度的鉴定,诱导羟自由基降解多糖,降解产物结构及相关性质的测定,影响龙须菜多糖提取率的三因素中，其主次顺序为：料水比时间温度 影响残次龙须菜多糖提取率的三因素中，其主次顺序为：温度时间料水比 多糖的最大提取率不变,说明跟正常的龙须菜比较,残次龙须菜的多糖含量并没有减少,藻体的细胞更容易破裂,多糖更容易提取.,多糖降解时间的确定,糖液的粘度随着降解时间的增加而下降，反应时间为2h的时候降解物的流出时间接近纯水的流出时间，降解反应基本完成。因而确定本实验中降解反应的时间为2h,降解剂浓度的确定,在降解剂浓度为110mmol/L时降解物的粘度变化明显,当降解剂浓度大于10mmol/L时,粘度接近水(1),则分子量基本不变,为了得到不同分子量的多糖,选择降解剂浓度为3，5，7，9mmol/L来进行降解,多糖及其降解产物体外抗氧化活性,对羟基自由基（OH）的清除力 对Fe3+的还原力测定：铁氰化钾法 对DPPH自由基的清除,.,随着多糖浓度的升高，其清除DPPH,清除羟自由基和还原能力都增强。随着多糖分子量的降低，多糖的体外抗氧化活性增强，但当分子量过低（1万）时，多糖的活性降低，可能是由于多糖的活性构型遭到破坏。,对-葡萄糖苷酶的抑制作用,-葡萄糖苷酶能催化-1,4糖苷键水解,是小肠内麦芽糖、蔗糖等寡糖水解的酶。-葡萄糖苷酶抑制剂通过抑制小肠刷状缘上-葡萄糖苷酶的活性,从而调节控制碳水化合物在肠道的吸收,达到防治餐后高血糖症和缓解高胰岛素血症的目的。,残次龙须菜多糖及其降解物的化学组成和分子量的测定,分子量的测定：凝胶过滤层析法 硫酸基含量的测定：明胶BaCl2法 3,6-内醚-半乳糖含量的测定：间苯二酚比色法 红外光谱扫描,分子量的测定：凝胶过滤层析法,取3mg Dextran blue 2000溶于3mL的蒸馏水中，加入到SephadexG-150层析柱中，并用0.1mmol/LNaCl洗脱，部分收集，每管1mL，用苯酚-浓硫酸法检测，测得外水体积Vo。在相同条件下测定已知分子量的标准葡聚糖（T-10、T-20、T-40、T-70，T-500）的洗脱体积Ve，根据Kav（VeVo）/（VtVo）对相应的分子量对数值（lgM）制作分子量标准曲线。复溶降解产物，同前处理，测定其洗脱体积Ve，根据标准曲线求出分子量。,硫酸基含量的测定：明胶BaCl2法,精确吸取00.2mL标准溶液（按0.004mL递升）于带塞试管中，各管以1mol/LHCL补加至总体积0.2mL，另加入3.8mL3%三氯乙酸和1mL氯化钡-明胶试液，混合后在室温下静置20分钟，测定（360nm）光吸收，以0管作对照，得A1；另以同样标准溶液系列，唯以明胶试液代替氯化钡-明胶试液，以0管作对照，测定光吸收（360nm），得A2，以A1-A2对硫酸基浓度作标准曲线。,3,6-内醚-半乳糖含量的测定：间苯二酚比色法,称取2.014g果糖，用饱和苯甲酸溶液配成100mL储备液。取1,2,3,4,5mL储备液各配成100mL不同浓度标准糖溶液。取1mL不同浓度标准糖液分别移入具塞试管中，将试管置于冰水浴冷却5min，分别加入5mL新配置的间苯二酚试剂，振摇均匀于80恒温下加热反应10min，取出于冰水浴冷却1.5min，即在550nm波长下进行比色，测出不同浓度标准果糖的消光值对其克分子浓度作标准比色曲线。,海藻多糖具有的活性与其硫酸基含量和分子柔韧性有关。一般硫酸基含量越高其生理活性越好；较低的分子柔韧性则可以增强其抗病毒活性，而分子量的柔韧性随着3,6-内醚半乳糖含量的减少而下降。降解产物的硫酸基含量与没降解前没有变化，也就是说自由基的降解没有导致残次龙须菜多糖的去硫酸化。而3,6-内醚半乳糖的含量则随着分子量的减少而降低，说明自由基可能攻击了3,6-内醚半乳糖，导致糖链上的糖环脱落。降解后的多糖具有比降解前的多糖具有更好的生理活性,对-葡萄糖苷酶的抑制作用,-葡萄糖苷酶能催化-1,4糖苷键水解,是小肠内麦芽糖、蔗糖等寡糖水解的酶。-葡萄糖苷酶抑制剂通过抑制小肠刷状缘上-葡萄糖苷酶的活性,从而调节控制碳水化合物在肠道的吸收,达到防治餐后高血糖症和缓解高胰岛素血症的目的。,不同分子量的多糖对-葡萄糖苷酶的抑制作用,原理：-葡萄糖苷酶抑制剂能抑制-葡萄糖苷酶催化水解对硝基苯基-D-吡喃葡萄糖苷产生对硝基苯酚 酶活性抑制率(%)=(A空白-A样品+A背景)/A空白100%,对多糖进行降解，适当的降低其分子量，有利于提高多糖对-葡萄糖苷酶的抑制率，但是分子量太低（低于1万），对-葡萄糖苷酶的抑制率会降低。因为多糖对-葡萄糖苷酶的抑制属于竞争性抑制，分子量适中的多糖更利于和-葡萄糖苷酶的活性中心结合，达到抑制效果,降血糖动物实验,结果测定中,小结,本文研究了残次龙须菜多糖降解的条件及多糖分子大小对抗氧化活性和降血糖的影响。以此来探讨多糖降血糖的作用途径. 结果表明，在一定分子量的范围内（大于1万），残次龙须菜多糖的抗氧化活性和降血糖活性随着分子量的降低而增强。 残次龙须菜多糖的抗氧化活性和-葡萄糖苷酶的抑制活性为其降血糖保健食品的开发奠定了基础,文章,1陈美珍, 宋彩霞, 陈伟洲, 杨拉维海芦笋提取物体外抗氧化活性的研究 食品科学 2陈美珍, 余杰, 杨拉维. 龙须菜多糖硫酸化对免疫活性的影响食品科学, 2010. 3 Mei-zhen CHEN,Hao-gui XIE,La-wei YANG,et al. In