HPLC-多菌灵等残留量.doc

高效液相色谱法同时测定果蔬中多菌灵、麦穗宁、甲基硫菌灵和硫菌灵的残留摘要 采用高效液相色谱法测定黄瓜、苹果和西红柿中四种杀虫剂多菌灵、麦穗宁、甲基硫菌灵和硫菌灵的残留量。样品经过乙腈提取，PSA净化后过滤膜，高效液相色谱分析，以乙腈/水（45/55, v/v）为流动相，在230 nm波长下检测。多菌灵、麦穗宁、甲基硫菌灵和硫菌灵在0.0510 mg/L范围内的峰面积与其浓度均呈现良好的线性关系，最低检出限分别为5.35、9.85、7.62和13.5 g/kg。保留时间的日内精密度和日间精密度分别低于0.89%和2.59%，峰面积的日内精密度和日间精密度分别低于2.59%和7.03%。样品的加标回收率在74.85%102.3%之间，相对标准偏差在0.47%6.40%之间。该方法操作简单、快速、灵敏，可用于果蔬中多菌灵、麦穗宁、甲基硫菌灵和硫菌灵的同时检测。关键字： 高效液相色谱；多菌灵；麦穗宁；甲基硫菌灵；硫菌灵1 引言苯并咪唑类杀菌剂是以有杀菌活性的苯并咪唑环为母体的一类高效低毒、广谱、内吸性杀菌剂。多菌灵、麦穗宁、甲基硫菌灵和硫菌灵都属于苯并咪唑类杀菌剂1，它们广泛应用于果蔬等多种作物的生长期和储存期病害的防治，兼具预防和治疗的作用，与此同时也造成了其在农产品及食品中的残留, 影响了产品的质量和人们的饮食安全。它们能通过叶片、种子渗入农作物体内，也可进入土壤、地表水等人类生存环境，对人、畜产生一定的毒副作用。联合国粮食及农业组织(FAO) 规定了多菌灵等杀菌剂在农产品中所允许的最高含量: 多菌灵0. 1 mg/kg(花生、甜菜、油菜籽等)、苯菌灵5 mg/kg(西红柿、甘蓝类蔬菜、芥菜等)、甲基硫菌灵2 mg/kg(香豌豆、芹菜、卷心菜)等。中国对农副产品中的多菌灵杀菌剂最终残留限量标准(MRLs)也作出了相应的规定:多菌灵3 mg/kg(梨、葡萄类水果等)、0. 5 mg/kg(黄瓜、西红柿等)2。近年来，随着苯并咪唑类杀菌剂在无公害水果生产中的日益推广，又由于国外严格的农药残留限量标准，因此高效、灵敏、快速的检测方法的研发迫在眉睫。目前，对多菌灵等农药残留的测定主要有薄层色谱法3、荧光分光光度法4、高效液相色谱法(HPLC)5-9、气相色谱法10、毛细管电泳法11、免疫学方法和生物法等。在已有的文献等的报道中，对多菌灵和甲基硫菌灵的检测以及这两种农药的同时检测的报道比较多12，对麦穗宁的残留检测的报道比较少，麦穗宁和多菌灵一样，也属于苯并咪唑类杀菌剂，如果使用不当，在杀菌杀虫的同时，在农产品中会造成一定的残留，因此，对麦穗宁的残留检测也具有一定的现实意义。另外，对多菌灵、麦穗宁、甲基硫菌灵和硫菌灵四种农药残留的同时检测还未见报道。本文用高效液相色谱法对多菌灵等四种农药在黄瓜、西红柿和苹果中的残留进行了检测，样品经过乙腈提取，PSA净化后过滤膜，HPLC分析。本文为多菌灵、麦穗宁、甲基硫菌灵和硫菌灵在果蔬中的残留检测提供了一种简单、快速、高效的方法。2 实验部分2.1 仪器与试剂LC310高效液相色谱仪（江苏天瑞仪器股份有限公司)；TG16-WS台式高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；HY-4调速多用振荡器（金坛市科析仪器有限公司）；KQ-400KDE型高功率数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；电子天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）。多菌灵、麦穗宁、硫菌灵和甲基硫菌灵(结构式如图1)的标准品均购自Sigma-Aldrich公司(中国上海)；N-丙基乙二胺（PSA）和二甲基亚砜（DMSO）购自阿拉丁试剂公司(中国上海)；甲醇和乙腈（色谱纯）购自北京百灵威化学技术有限公司；无水硫酸镁(分析纯)；实验用水均为Milli-Q（美国Millipore公司）。2.2 溶液的配制 分别精密称取多菌灵、麦穗宁、硫菌灵和甲基硫菌灵标准品10.0 g，溶解在10 mL DMSO溶液中，制成1.0 mg/mL的标准储备液。标准工作溶液用甲醇/水（45/55，v/v）稀释。溶液放于4的冰箱中保存备用。2.3 色谱条件 Waters C18色谱柱（250 mm 4.6 mm，5 mm），每一次实验结束，色谱柱要用100%有机相彻底冲洗；流动相为乙腈/水（45/55，v/v），流速为1.0 mL/min；紫外检测波长为230 nm；进样量为20 mL；实验采用外标法定量。所有试剂在使用前都要过0.45 mm的滤膜。2.4 样品前处理13,142.4.1 试样的制备 分别取黄瓜、西红柿和苹果样品，取可食用部分，将样品用打浆机粉碎匀浆，制成试样备用，剩余试样于-18下保存。2.4.2 样品的提取 分别称取2.5 g三种果蔬试样于10 mL具塞离心管中，加入2.5 mL乙腈，振荡使其混合均匀，然后加入1.5 g无水硫酸镁，剧烈振荡2 min，静置30 min，然后离心，在2500 r/min的转速下离心5 min，使乙腈相和水相分离。2.4.3 样品的净化 移取1.0 mL上层乙腈溶液，加入200 mg无水硫酸镁和50 mg PSA吸附剂，在2500 r/min的转速下离心5 min，吸取上层乙腈溶液，过0.2 mm的有机滤膜，进高效液相色谱仪检测。图1 分析物的结构式 多菌灵（Carbendazim)；麦穗宁（Fuberidazole）；甲基硫菌灵（Thiophanate-methyl）和硫菌灵（Thiophanate）Fig. 1 Structure of analytes3 结果与讨论3.1 色谱条件的选择高效液相色谱进行分离检测主要的影响因素有流动相的选择及其比例和检测波长的选择等。在流动相选择时，分别选择了常用的乙腈/水和甲醇/水作为流动相进行了分离检测。实验表明，乙腈的分离效果要比甲醇好，峰形也比较好。流动相的比例对分离效果有很大影响，乙腈的比例为50%时，多菌灵的出峰时间提前，和溶剂峰无法达到基线分离，且麦穗宁和甲基硫菌灵也不能达到基线分离；当乙腈的比例为40%时，多菌灵和溶剂峰达到基线分离，麦穗宁和甲基硫菌灵也完全达到基线分离，但是四种标准品完全分离所需要的时间过长；调节乙腈的比例为45%时，四种标准品的分离效果好，且完全分离所需要的时间有所提前，故选择乙腈/水的比例为45/55（v/v）。流动相的流速对四种农药的分离影响不大，故选择了1.0mL/min。 在选择检测波长时，为了兼顾四种农药的灵敏度，分别选择了230 nm和286 nm进行考察，结果表明，在230 nm的检测波长下，四种分析物的灵敏度较高，所以检测波长选择230 nm。3.2 标准曲线和检出限配制多菌灵、麦穗宁、甲基硫菌灵和硫菌灵质量浓度均为0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、5.0和10.0 mg/L的系列混合标准溶液，在最佳色谱条件下进样，测定其峰高和峰面积，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制混合标准溶液的工作曲线，得到多菌灵、麦穗宁、甲基硫菌灵和硫菌灵的标准曲线回归方程分别为y = 6534.0 x + 746.21（R2 = 0.9992）、y = 4058.3 x + 347.55（R2 = 0.9995）、y = 7447.2 x + 128.14（R2 = 0.9998）和y = 8171.7 x - 207.90（R2 = 0.9997）。结果表明，在0.05 10.0 mg/L范围内，各标准品质量浓度与峰面积值具有良好的线性关系。以空白样品的3倍信噪比（3S/N）确定各物质的最低检出限分别为：多菌灵5.35 g/kg；麦穗宁9.85 g/kg；甲基硫菌灵7.62 g/kg和硫菌灵13.49 g/kg。3.3 重现性和精密度 配制多菌灵、麦穗宁、甲基硫菌灵和硫菌灵质量浓度均为1.0 mg/L的混合标准溶液，日内连续进样6次和日间累计进样6次，得到各物质的保留时间和峰面积值，计算其日内精密度和日间精密度。结果见表1，4种多菌灵农药的日内保留时间和峰面积的相对标准偏差值分别低于0.89%和5.65%，而日间保留时间和峰面积的相对标准偏差值分别低于2.59%和7.03%。由此可见，该方法重现性行良好，对多菌灵等农药的检测具有良好的精密度。表1 重现性和精密度实验Table 1 Results of reproducibility and precision tests相对标准偏差（RSD，%）日内精密度 (n = 6)日间精密度 (n = 6)保留时间峰面积保留时间峰面积多菌灵0.712.080.773.96麦穗宁0.894.241.413.74甲基硫菌灵0.585.651.344.53硫菌灵0.863.162.597.033.4 样品测定及回收率实验分别取三种空白果蔬样品和分别添加0.2、0.5和1.0 mg/L 3个水平的4种农药标准品的果蔬样品，按照上述样品的提取和净化方法进行处理，HPLC检测，平行测定6次，进行加标回收率测定，其结果见表2。多菌灵、麦穗宁、甲基硫菌灵和硫菌灵在三种样品中的平均回收率数值分别为74.85%97.19%、75.41%96.27%、78.38%95.96%和83.81%102.3%，相对标准偏差值分别为0.47%6.40%、0.98%3.02%、1.01%4.24%和0.87%3.6%。实验得到空白样品和加标样品（1.0 mg/kg）的谱图（图2、图3、图4），从中可以看出，三种空白果蔬样品中都没有多菌灵等农药残留。表2 回收率和精密度实验Table 2 Results of recovery and precision tests杀菌剂标准加入量(mg/kg)回收率 (%)相对标准偏差RSD (%)黄瓜西红柿苹果黄瓜西红柿苹果多菌灵0.288.4074.8583.780.471.164.170.597.1981.2083.522.241.832.761.097.0489.4979.806.403.170.86麦穗宁0.276.0691.5587.405.312.011.570.578.9695.5875.412.242.972.541.096.2791.6483.791.220.983.02甲基硫菌灵0.295.9689.3289.601.182.261.330.594.1083.6586.424.243.191.011.090.4978.3880.772.471.022.13硫菌灵0.294.6783.8189.713.602.081.210.588.5087.7588.722.263.320.871.0102.3386.8393.761.632.472.06图2 空白苹果样品（A）和加标苹果样品(B)谱图 Fig. 2 Chromatograms of blank apple sample ( A) and apple sample ( B) with addition of standard solutions1. 多菌灵（Carbendazim)；2. 麦穗宁（Fuberidazole）；3. 甲基硫菌灵（Thiophanate-methyl）；4. 硫菌灵（Thiophanate）图3 空白黄瓜样品（A）和加标黄瓜样品(B)谱图Fig. 3 Chromatograms of blank cucumber sample ( A) and cucumber sample ( B) with addition of standard solutions图4 空白西红柿样品（A）和加标西红柿样品(B)谱图Fig. 4 Chromatograms of blank tomato sample ( A) and tomato sample ( B) with addition of standard solutions4. 结论 本实验采取高效液相色谱法对几种常见的果蔬中多菌灵等农药的残留进行了分析，样品经乙腈提取，PSA吸附剂净化，HPLC检测。实验结果表明，本实验采取的方法简单、快速、高效，方法的检出限低，重现性和精密度良好，适合果蔬中多菌灵等农残的测定。References1 A. 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