过氧化氢酶活动度测定法测定大米新陈度.doc

过氧化氢酶活动度测定法测定大米新陈度广东食品药品职业学院食品科学系2010级食品药品监督管理林俊武广东食品药品职业学院食品科学系2010级食品药品监督管理陈龙华广东食品药品职业学院食品科学系2010级食品药品监督管理汪智杨摘 要利用过氧化氢酶活动度测定法，主要针对大米陈化过程中过氧化氢酶活动度的改变对其新陈度影响进行鉴别，计算出不同年份大米的过氧化氢酶的活动度，再与愈创木酚反应法结果对比，确定新陈大米之间过氧化氢酶活动度的差距。关键词：过氧化氢酶活动度测定法 大米新陈度 愈创木酚反应法1 前言：随着国民经济的发展，许多食品已不断完善其品质检验与鉴别的法规。其中新陈度已成为检验与主要项目。且大米作为我国城镇居民主要食粮，是我们生活中不可或缺的。大米经过长时间的贮存后，由于温度、水分等因素的影响，大米中的淀粉、脂肪和蛋白质等会发生变化，使大米失去原有的色、香、味，营养成分和食用品质下降，甚至产生有毒有害物质（如黄曲霉毒素等），即大米陈化。贮存时间、温度、水分和氧气是影响大米陈化主要因素，另外大米品种、加工精度、糠粉含量以及虫霉危害也与大米陈化有密切关系。大米陈化速度与贮存时间成正比，贮存时间愈长，陈化愈重。水分大，温度高，加工精度差，糠粉多，大米陈化速度就快。不同类型的大米中糯米陈化最快，粳米次之，籼米较慢，目前鉴别大米新陈度方法有GB/T2715-81、GB/T5492-85的感官鉴定，GB/T5502-85、GB/T5594-85GB/T5503-85、GB/T5503-85、GB/T5496-85对大米中黄曲霉素B1、油脂、水分、直链淀粉测定进行规定。2 实验目的：2.1 大米的新陈度是鉴别大米优劣的主要指标。2.2 学习并掌握过氧化氢酶活动度测定法。2.3 学习并掌握愈创木酚反应法测定大米新陈度的方法。3 实验原理：粮食陈化后生理变化主要表现为酶活性大大降低或丧失，生活力下降或消失，呼吸趋于停止或完全停止。在pH7.7条件下，从样品中提取过氧化氢酶，在提取液中加入一定量的过氧化氢，使过氧化氢在过氧化氢酶作用下分解，再用高锰酸钾溶液滴定过量的过氧化氢。根据高锰酸钾溶液的消耗量计算出试样中过氧化氢酶活动度。过氧化物酶是一种以血红素为辅基、可直接催化过氧化物反应的酶。在过氧化物酶作用下，H2O2放出活性很强的原子态氧O，氧化愈创木酚生成臭氧化物、四愈创醌，氧化产物是红褐色的。粮食愈新鲜，过氧化物酶活性愈强，反应产物的红色愈深。陈米因过氧化物酶活性降低或完全丧失，而不显色。4 实验设备4.1 实验仪器电热恒温水浴锅（室温+599）、电炉、天平4.2 实验器材100ml锥形瓶、10、15ml量筒、5、10、20ml移液管、酸式滴定管、漏斗、比色管、洗耳球、铁架台、玻璃棒、研钵5 实验材料及试剂材料某一品牌2009、2010、2011年所产的大米、3%过氧化氢溶液（取30%过氧化氢溶液3ml加水稀释至30ml）、蒸馏水、10%硫酸溶液、0.1N高锰酸钾标准溶液、pH7.7索伦逊磷酸盐缓冲液（甲液，称取磷酸氢二钠11.876g溶于1水中。乙液，称取磷酸二氢钾9.078g溶于1L水中。临用时，甲、乙液按9：1混合。）、石英砂、1%愈创木酚6 实验操作步骤6.1 分别称取2009、2010和2011年大米试样约1g(m)，精确至0.01g，分别用倒入3个研钵中加少量细砂，量取3份缓冲液50mL，先倒出510mL于各研钵中，细磨至糊状后，然后经漏斗分别倒入锥形瓶中，用剩余的缓冲液洗净研钵和漏斗，再把洗液倒入相应的锥形瓶内，剧烈振摇5min，静置23h。 6.2 在等待时再分别取试样各约50粒置于试管中，加入1%愈创木酚2ml，震荡5min后，加3%的过氧化氢溶液1-3滴，震荡放置5min。观察记录结果。6.3 将6.1中静止后的液体过滤至比色管中。吸取20mL滤液注入锥形瓶中，加入20mL水和3mL3%过氧化氢溶液，摇匀后在30恒温水浴锅放置15min，加入5mL10%硫酸溶液，摇匀，用0.1N高酸钾溶液滴定剩余的过氧化氢，滴定至微红色且30s不褪色为止，记录消耗的高锰酸钾溶液毫升数（1）。6.4 用托盘天平称取以上样品各10 g，置于100 ml 三角瓶中，加入30 ml 试液， 振荡12 min，观察并记录溶液颜色。每个样品做三个平行实验。6.5 吸取20mL提取液注入锥形瓶中，置于沸水浴中加热5min，或用直接煮沸法破坏过氧化氢酶。冷却后加20mL水和3mL3%过氧化氢溶液于锥形瓶中，在室温下放置1530min，再加入10%硫酸溶液5mL，摇匀，用0.1N高锰酸钾溶液滴定剩余的过氧化氢，滴定至微红色且30s不褪色，记录消耗的高锰酸钾标准溶液体积（2）。6.6 实验结束后计算、对比和总结结果并清洗收拾仪器。7 结果及计算试样年份米粒色相显色时间200920102011过氧化氢酶活动度X按式（1）计算：X =（V0 V1）17100 （1）式中：X过氧化氢酶活度（以干基计），单位为毫克过氧化氢酶每克（mg H2O2/g）V0空白试验用去高锰酸钾体积，单位为毫升（ml）V1试样滴定用去高锰酸钾体积，单位为毫升（ml）c实际高锰酸钾标准溶液浓度，单位为摩尔每升（mol/L）m试样质量，单位为克（g）M试样水分