人工低密度脂蛋白与紫杉醇油酸为胶质母细胞瘤靶向药物递送载体.docx

Z杂志控释124卷，第3期2007年12月20日，页163-171合成纳米低密度脂蛋白与紫杉醇油酸为胶质母细胞瘤靶向药物递送载体摘要低密度脂蛋白（LDL）受体已显示在GBM肿瘤细胞中上调体外，因而对治疗剂的递送的潜在分子靶标。一种合成纳米LDL（nLDL）粒子是作为通过将亲脂性前体药物，紫杉醇油酸盐，进入粒子靶向GBM细胞的药物递送载体。含紫杉醇油酸酯（nLDL-PO）纳米LDL是通过将包含脂质结合基序和低密度脂蛋白受体（LDLR）结合载脂蛋白B-100的结构域，其包括磷脂酰胆碱，甘油三油酸酯，和紫杉醇的脂质乳剂的合成肽构建油酸。紫杉醇油酸盐掺入脂质颗粒的核心。nLDL-PO细胞存活在GBM细胞系中被发现是时间，浓度和细胞系依赖。细胞杀伤观察短的药物孵化，并在6小时表现出饱和。在LDL受体抑制剂，苏拉明的存在nLDL-PO细胞存活的提高，这表明该药物是通过LDL受体传递。总的来说，这些数据有力地表明，在合成的纳米LDL中可以将亲脂性药物，并且能够杀死GBM细胞。nLDL-PO具有作为一种选择性药物递送载体用于通过LDL受体靶向GBM肿瘤的潜力。关键词 低密度脂蛋白; 胶质母细胞瘤; 紫杉醇; 低密度脂蛋白受体; 脂肪乳剂1。介绍胶质母细胞瘤（GBM）的是，占近40的原发性脑肿瘤在成人高度侵略性的恶性肿瘤1。传统的治疗包括手术后放疗和化疗有成效有限，中位生存时间为确诊大约为1年。尤其是全身化疗交付提供了基本福利到GBM患者，其效用受到质疑2。药物可施用于患者的量是由高的全身毒性和众多的副作用的限制。一种用于规避与化疗相关的毒性是开发车辆的选择性靶向上调肿瘤细胞上的细胞受体3。这样的靶向药物递送载体必须提供高剂量的药物的肿瘤，同时保留周围的健康组织的潜力。七GBM细胞系的研究显示，这些细胞已上调低密度脂蛋白受体（LDLR）s和128,000与950,000与不同的受体每个细胞的受体的数量4。研究LDLR的正常大鼠和猴脑组织中的分布表明，正常脑组织，尤其是神经元，具有相对低的LDLR数量5。如此看来，该低密度脂蛋白受体是选择性递送的抗肿瘤化合物的GBM一个潜在的分子靶标。有人曾建议血浆衍生的LDL，对于LDLR的主要配体，可作为药物递送系统的肿瘤表达LDLR6和7。LDL是一种疏水性的脂质，主要是胆甾醇酯与少量的三酸甘油酯，它可用于亲脂性药物掺入的芯组成的22-27纳米的颗粒。表面由磷脂，未酯化胆固醇和载脂蛋白B-100（载脂蛋白B）的一个分子的8。载脂蛋白B是550000沓糖蛋白具有9个氨基酸（残基3359-3367），其作为用于LDL受体的结合结构域10。结合后在网格蛋白小窝的低密度脂蛋白受体，LDL是通过细胞内吞作用和动作内化入其中pH值下降会导致受体的LDL解离核内体。该受体被再循环回到细胞表面，而LDL被移动到那里的粒子被降解溶酶体10。在以前的研究中，抗癌药物已被直接地加载到血浆LDL11或LDL的脂质核心分别代替药物12，13，14，15，16， 17， 18和19。天然LDL，虽然是不太理想的作为靶向剂，因为它是难以大量地分离，并且是可变的成分和尺寸。另一种方法中使用的重构的LDL由含药物的稳定的脂质乳剂的纯化载脂蛋白B20，21，22和23。的载脂蛋白B蛋白，然而，是难以分离，由于其大尺寸和聚集倾向，因此不用于产生重组的LDL的大批量有用。最近的研究表明创建一个合成的LDL颗粒的可行性。两个这样的研究，开发了一种合成的LDL颗粒作为替换为血清中的细胞培养基用脂质乳剂和载脂蛋白B的低密度脂蛋白受体结合结构域组成的肽24和25。这种合成的颗粒能够通过经LDL受体交付胆固醇的细胞，支持细胞生长。在另一种方法中，我们最近描述的合成纳米颗粒的LDL（nLDL），作为治疗GBM一个潜在的药物递送载体26。该nLDL是由脂肪乳剂和一种独特的双功能肽，其包含脂质结合结构域和9个氨基酸的LDLR结合结构域。我们的新nLDL模仿的血浆提取低密度脂蛋白的行为，并能针对低密度脂蛋白受体的GBM细胞的。该颗粒的脂质核心有把亲脂性的细胞毒性药物的潜力，但是这尚未得到证实。本研究的目的是要表明，我们的合成nLDL可以在文化传递的亲脂毒性抗癌药物的有效载荷，以GBM细胞。紫杉醇的亲脂性衍生物，紫杉醇油酸酯（PO）27，被用来作为一个试验药物。这样的前药通过破坏所需的细胞分裂的正常微管动力学导致细胞死亡28。我们表明，合成的纳米LDL装载紫杉醇油酸酯（nLDL-PO）进入细胞通过低密度脂蛋白受体，并能够在培养杀死GBM细胞。2。材料和方法2.1。物料三油精（TO），胆甾醇油酸酯（CO），紫杉醇，油酰氯，乙腈，三氟乙酸（TFA），丁基化羟基甲苯（BHT），和1无脂肪酸牛血清白蛋白（BSA）购自Sigma公司。最小必需培养基（MEM），胎牛血清（FBS）和胰蛋白酶-EDTA是从加州大学旧金山分校细胞培养设备获得的。Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）购自Invitrogen公司获得的。苏拉明从AXXORA，LLC（圣地亚哥，CA）获得。蛋黄磷脂酰胆碱（PC）中的自Avanti极性脂质获得的。脂蛋白缺乏血清（LPDS）从Intracel（弗雷德里克，MD）获得。用于生产nLDL-PO的29个氨基酸的肽被前面描述的26和肽从生物合成公司（路易斯维尔，TX）获得的在大于95的纯度通过HPLC分析测定的。2.2。紫杉醇油酸酯的合成紫杉酚（100毫克，0.117毫摩尔）加入到10 mL的火焰干燥的圆底烧瓶中，并在惰性气氛（氩气）下放置。干燥氯仿溶液中加入（1毫升），并将反应冷却至0。几分钟后1.3当量的油酰氯（50.3微升，0.152毫摩尔），接着加入三乙胺（20.8微升，0.152毫摩尔）。将反应维持在015分钟，然后温热至室温。在室温下4小时后，将反应混合物稀释，用5毫升氯仿中，将有机层依次用10碳酸氢钠水溶液（5mL）中。除去有机层，水层用氯仿（25毫升）萃取两次。将合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并除去溶剂。将粗残余物溶解于250L的1甲醇/氯仿，并使用由100毫升1甲醇/氯仿，100mL的梯度溶剂系统通过快速柱色谱（硅胶25g，用Whatman 60埃,230-400目）进行纯化1.5甲醇/氯仿和最后2甲醇/氯仿，直到完全洗脱产物。鉴定通过薄层色谱级分含有紫杉醇油酸盐（RF 0.37，3甲醇/氯仿，玻璃背硅胶板Analtech Uniplate钢板，250微米厚，5厘米10厘米，4mm时，荧光指示剂254nm的用UV ）并合并，得到119毫克无色泡沫（91收率），将其在使用前在真空下彻底干燥。该产物的身份通过在Bruker的Avance 300 MHz核磁共振仪（加州大学伯克利分校）核磁共振和通过在Finnigan LCQ双核仪器质谱验证。2.3。药物定量反相高效液相色谱法（HPLC）协议的开发是为了量化紫杉醇和紫杉醇油酸盐中的乳剂和合成纳米LDL。样品上附着在Perkin Elmer 200系列高效液相色谱机器和吸光度月神5C-18分析柱（2504.6毫米的Phenomenex）执行读取227纳米（珀金埃尔默200系列紫外/可见光检测器）。紫杉醇油酸盐洗脱含0.05TFA的乙腈以1.0毫升/分钟的流速，并且具有约11分钟的柱保留时间。紫杉醇，另一方面，洗脱用0.05TFA的50:50的乙腈 - 水，以0.5毫升/分钟的流速，并且具有约25分钟的柱保留时间。峰下面积采用数值积分（辛普森法则）计算。标准曲线是使用溶解在甲醇中已知量的紫杉醇和紫杉醇油酸盐的开发。2.4。生产合成纳米低密度脂蛋白与紫杉醇油酸（nLDL-PO）脂肪乳剂形成如前所述26。乳液包括PC和在3:2的摩尔比（PC：11.25毫克，TO：8.73毫克）。紫杉醇油酸盐溶解在甲醇中，并添加到初始的脂质混合物。脂质和药物进行了氮气下干燥。tris-盐水缓冲液（6毫升，20毫摩尔Tris，pH 7.2）中导入干燥的脂类和药物，并且然后将溶液旋涡处理在低设置1分钟。将该溶液超声处理（布兰森洗净器，索尼）为35分钟，在设定3，在冰上，以破坏较大的脂质复合物。超声处理的颗粒进行纺丝，20分钟，以3000rpm的转速，以除去颗粒和未结合的药物。使用如前面所描述的阿凡提极性脂质挤出脂质乳剂挤出26和最终的乳液过滤通过0.22微米过滤灭菌。乳液与药物结合在2.15微米（1.27毫克/毫升）的合成肽。将混合物轻轻涡旋混合1分钟，然后孵育30分钟，在室温下进行。未结合的肽除去透析的Tris-生理盐水缓冲液，在4，在24小时的时间间隔两个变化。2.5。组成和颗粒大小粒子的脂质成分，使用从光（里士满，弗吉尼亚州）的酶比色测 定法测定甘油三酯和磷脂。蛋白定量的马克韦尔方法29。紫杉醇油酸盐和紫杉醇浓度通过如上所述的反相HPLC测定。nLDL-PO来自三个独立实验的组合物进行了测定脂质和蛋白组成的可重复性。颗粒的大小由负染色电子显微镜如前所述测定30。2.6。细胞培养HeLa细胞得自ATCC并培养在DMEM培养液含10FBS（37，5CO2）。GBM细胞系（SF-767，U-251，SF-763）是从脑肿瘤研究中心（加州大学旧金山分校，加利福尼亚州）的组织库取得及所描述的卡拉汉生长本质11在老鹰的最低必需培养基（MEM）的补充有1非必需氨基酸，1g / L的葡萄糖，0.292克/ L谷氨酰胺，2.2 g / L的碳酸氢钠和10胎牛血清。2.7。荧光显微镜为研究确定的摄取荧光标记的颗粒，细胞铺板在5104，每孔的细胞在实验室康II，2 -孔室玻片。允许细胞脂蛋白缺乏的胎牛血清（LPDS）在上述MEM被放置于细胞之前生长48小时。实验是成倍增长的细胞，在大约70汇合，除了LPDS媒体24 h后进行的。在每个实验结束时，将细胞用PBS含1无脂肪酸BSA洗涤两次。细胞固定在PBS中的4多聚甲醛中15分钟，在室温下PBS中漂洗后。荧光显微镜进行了使用蔡司200M AXIOVERT光学显微镜。数字图像被捕获的图像专业软件。荧光图像在40的放大倍率获得的。2.8。直接成像显微镜之前和之后添加nLDL-PO的活细胞上观察蔡司200M AXIOVERT光学显微镜。数字图像被捕获的图像专业软件。2.9。nLDL-PO毒性的测定以确定细胞毒性暴露于nLDL-PO，将细胞在96孔板（Nunc公司）的200L的媒体铺板于2500个细胞/孔。允许细胞脂蛋白缺乏的胎牛血清（LPDS）在上述MEM或DMEM被放置于细胞之前生长48小时。实验是指数生长的细胞中，在大约40汇合时，除了LPDS媒体的24小时后进行了。在每个实验结束时，将培养基从细胞中除去和新鲜的培养基100L的比例添加。该CellTiter96非放射性细胞增殖测定法（Promega）中，使用根据制造商的指示来量化细胞的存活。吸光度在同一天被读取570 nm处的分子器件光谱最大340酶标仪。为了确定的细胞存活，吸光度值标准化抵销收到的Tris-缓冲盐水同等音量控制井。细胞存活的作图（-轴）对药物浓度（x轴，对数的底数2级）。在IC50，这是为了杀死半数细胞所需的浓度，进行测定。2.10。统计学生的吨检验（双尾）用于测定IC之间显著差异50或在实验药物浓度。P-值小于0.05被认为是显著。3。结果3.1。nLDL-PO表征我们以前表明，合成的纳米LDL配制的磷脂酰胆碱的摩尔比（PC）：三油酸甘油酯（TO）：（CO）3点02分01秒的胆固醇油酸酯包含在最终只有一小部分的CO（3）产品26。因此，我们测试了CO在乳剂是否有必要为PO掺入nLDL，发现CO的存在或不存在对PO结合（数据未显示）没有影响。因此，胆固醇油酸酯被排除在今后所有的乳液配方。以确定最佳的药物浓度对于生产含药乳液，PO加入到初始的脂质混合物（PC：TO，3:2）在不同浓度（0.083-0.67毫克/毫升）和PO的掺入量为量化，如图所示。1A。紫杉醇油酸掺入出现饱和周围0.33毫克/毫升PO它产生的PO 48.56.5，回收率在最后的乳液，所有进一步的研究进行了在这个PO浓度。在乳剂的制造中，观察并溶解在甲醇中在玻璃上超声处理管的壁中的残基。甲醇的样品通过HPLC运行和PO的量进行定量。它被确定PO没有结合到乳液中已经吸附在玻璃上。以确定是否有在PO与非衍生紫杉醇的掺入有差别，乳液与任何紫杉醇或紫杉醇油酸等摩尔量进行。紫杉醇油酸盐示范显著更大的掺入比紫杉醇（脂质乳剂P= 0.004）。图。1乙演示中掺入紫杉醇油酸盐相比，紫杉醇与紫杉醇的衍生化的增加的亲脂相一致的4倍增加。图。1。紫杉醇油酸纳入脂肪乳剂。a）注册成立的PO在一个范围0.083-0.67毫克/毫升到乳液;饱和度约发生0.33毫克/毫升的采购订单。B）紫杉醇与紫杉醇为油酸脂乳液的掺入，PO的初始金额为0.3毫米。药品注册成立肽结合的C）的影响; 2.15微米（1.27毫克/毫升）肽使用。肽对PO注册成立四）影响。紫杉醇油酸盐和紫杉醇浓度通过反相HPLC定量。每个数据点代表三个单独生产的乳液的平均值SD。的水平栏表示由发现显著差异吨测试。图选项该nLDL-PO的最终制剂（重量）为：肽，286，PC，402;于，267;和PO，61（= 3）。以确定是否PO的存在改变了肽结合到乳液中，乳液具有和不具有PO的肽含量进行评价。如见于图。1C，PO的存在不影响该肽结合到乳液的能力。另外，通过添加肽含有PO乳剂没有显著影响乳液（中的药物含量图1D）。总而言之，这些结果表明，PO结合到颗粒的核心。该nLDL-PO颗粒电子显微镜显示，他们主要是圆形，8-15纳米直径的颗粒。3.2。nLDL-PO在SF-767细胞摄取之前我们已经表明，如果没有药物的合成nLDL由GBM细胞培养内化26。要验证加载nLDL与PO不会改变粒子的吸收，FITC标记的nLDL-PO颗粒培养与SF-767 GBM细胞系在37前3小时（1.5微米肽在200微升的媒体）荧光显微镜。如见于图。2A，FITC标记的nLDL-PO是由SF-767细胞内化。图。2。的nLDL-PO和细胞杀伤通过nLDL-PO细胞摄取。A）FITC标记nLDL-PO的细胞摄取的代表图像。左：细胞的明场图像，中东：通讯FITC标记nLDL（1.5微米肽），右的荧光图像：FITC标记的肽相应的荧光图像与细胞核用DAPI染色合并。B）在nLDL-PO细胞杀伤HeLa细胞。该IC50为6.5微米（24小时）和0.7微米（72小时）为nLDL-PO。C）细胞由nLDL-PO杀SF-767细胞。该IC50为7.9微米（24小时）和3.6微米（72小时）为nLDL-PO。数据代表了三个不同的孔的平均值标准差。这些实验重复与单独导出nLDL-PO，取得了类似的结果。图选项3.3。与HeLa细胞和SF-767细胞的毒性研究以前的工作由Lundberg等人27表明，装有油酸紫杉醇脂质乳剂能有效杀灭HeLa细胞培养。我们利用这些细胞，与GBM细胞系SF-767一起，以确定合成纳米低密度脂蛋白装有PO是否可以杀死细胞的培养。在图2B-C，这两个细胞系暴露于用于评估可达72小时，细胞存活的范围PO（0.63-20微米）的。很明显，细胞杀伤与nLDL-PO是时间和浓度依赖性，其中72小时暴露是显著大于在每一种情况下24小时。在72小时后，将集成电路50对HeLa细胞为0.7M相比，3.6M为SF-767细胞。在两种细胞系中，nLDL-PO证明显著更大的细胞杀伤作用比单独PO。这些结果表明，nLDL-PO可以杀死细胞，并比单独的药物更有效。要验证细胞的杀伤，而不是细胞的生长迟缓，发生，直接图像显微镜使用（图3）。引入nLDL-PO之前，健康SF-767细胞被看作簇梭形细胞（图3中的A）。温育不含药物72小时的对照细胞显示细胞表示细胞的持续增长（的紧密堆积的单层图3的B）。图。3一个72小时的温育与nLDL-PO（20M和5M的PO，分别）之后的C-D显示细胞。在药物浓度较高时，几乎所有的细胞都死了，而在低浓度少数细胞似乎都活了下来。孵育单独紫杉醇油酸酯（5M）或nLDL无药物（8M肽）72小时额外的细胞，表现出细胞的紧密堆积的单层（数据未示出），类似于对照细胞没有药物。图。3。SF-767细胞的前孵育nLDL-PO后直接图像照片。细胞培养在96孔板中孵育nLDL-PO之前72小时。A）紧接孵化与药物细胞，B）在没有nLDL-PO的72小时生长的细胞，细胞融合。C）细胞后72 h后用20微米nLDL-PO，只有小圆形死细胞均可见，D）细胞后72 h后用5微米nLDL-PO。细胞的数量被大大减少相比，“B”和只有少数细胞似乎是可行的。图片拍摄于一个10的放大倍率。在右下角栏标记表示约110微米。图选项为了模仿临床药代动力学，用快速药物消除，将细胞脉冲孵育nLDL-PO为1，3，6，12，24，或72小时之后，洗涤细胞并培养在无药物培养基中的72小时总孵化时间。集成电路50（图4）减少为培养时间与nLDL-PO增加，但是6和12小时（集成电路之间的相同5010M）。IC5012小时和24小时之间的降低，但为24和72小时之间是相同的（IC503M）。在IC初始高原50于12小时显示饱和度在药物的吸收，这是受体介导的摄取低密度脂蛋白受体的特征。所有其他的细胞进行了研究，用更短的孵育时间与nLDL-PO（即3小时或6小时）。图。4。时间和浓度对SF-767细胞杀伤通过nLDL-PO的影响。细胞暴露于nLDL-PO（0.08-20微米的药物）的时间（1，3，6，12，24，72 h）本nLDL-PO被删除后，没有药物的新鲜培养基可变长度，加入细胞对于一个72小时总孵化。该nLDL-PO浓度在其中50的细胞存活观察（IC50值）分别为：20M（1小时），13.3M（3小时），9.9M（6小时），9.8M（12小时），3.5M （24小时），和3.4M（72小时）。数据代表在同一试验内三次重复的平均值标准差。此实验重复与单独衍生批次nLDL-PO，并且得到相似的结果。图选项3.4。nLDL-PO需要摄取低密度脂蛋白受体我们先前的研究显示26认为nLDL摄取阻断低密度脂蛋白受体抑制剂，苏拉明31。以证明通过LDLR发生的药物递送，细胞用10MnLDL-PO加苏拉明（10毫米），用于除去后两种化合物和新鲜培养基而不nLDL-PO和抑制剂溶液中加入额外69 H 3小时潜伏期（共72个小时的培养）。图。5表明，细胞杀死了显著（P= 0.001），效率较低（51存活），当LDLR被阻断与苏拉明相比无苏拉明（12存活）的控制。后者的支持，该药物通过低密度脂蛋白受体进入细胞的前提。图。5。苏拉明对nLDL-PO细胞杀伤效率的影响。nLDL-PO（10M）加入到SF-767细胞有和没有10mM的苏拉明3小时的nLDL-PO和苏拉明除去之后;新鲜培养基而不药物加入到细胞中的72小时总孵化。数据代表了三个不同的孔的平均值标准差。此实验重复与单独衍生批次nLDL-PO，并且得到相似的结果。的水平栏表示由发现显著差异吨测试。图选项3.5。细胞的存活与SF-767，SF-763和U-251细胞的比较这是以前观察到不同的GBM细胞系中有每个细胞LDL受体的数量可变的4。为了确定细胞受体数量是否会影响细胞的杀伤通过nLDL-PO，三GBM细胞系SF-763，SF-767和U-251细胞有950,000，288,000，128,000和每个受体细胞，分别进行了检查。细胞与不同浓度的药物（0.08-20微米）的用于除去药物后6小时和新鲜的培养基没有药物溶液中加入66小时温育（72小时总孵化）。图。6表明，在IC50值分别为：SF-763，2.2微米，SF-767，7.5微米，和U-251，6.9微米。有显著差异（P0.05）之间的IC50相比，SF-767和U-251细胞其中SF-763细胞更敏感的药物为SF-763。在IC之间未观察到细胞的杀伤无差异50SF-767和U-251细胞。图。6。（：，：288,000，和U-251：128,000感受器每个细胞SF-767 950,000 SF-763）nLDL-PO对表达不同的低密度脂蛋白受体数目3 GBM细胞株存活率的影响。细胞与nLDL-PO为除去nLDL-PO后6小时和新鲜培养基而不药物加入到细胞中的72小时总孵化。数据代表了三个不同的孔的平均值标准差。此实验重复与单独衍生批次nLDL-PO，并且得到相似的结果。图选项4。讨论高级别胶质瘤难以治疗，因为他们成长积极和细胞胰岛经常保持肿瘤手术切除后。这些残余细胞导致肿瘤复发。近年来，重点用于治疗神经胶质瘤，以及其他类型的肿瘤，已经成为特定分子靶的鉴定用于药物递送。这样的分子靶点可以最大限度地减少对周围正常组织的毒性作用。表皮生长因子受体32，血小板衍生生长因子受体33，成纤维细胞生长因子受体34，人类表皮受体2型35，和白细胞介素13受体的36已被证明是向上在胶质瘤细胞调控。而LDL受体是稀疏正常脑组织5，我们曾表明，人类GBM细胞系表达高水平的LDL受体4，这表明LDL受体可能代表一个唯一的目标，可用于直接交付化疗药物对肿瘤细胞的对流增强交付技术37。而血脑屏障（BBB）可能拥有的LDL受体，可以发挥内吞或transcytose低密度脂蛋白38，39和40，GBM肿瘤缺乏BBB2和41。其中内皮细胞中的健康组织的BBB将受到由LDL受体的程度靶向治疗是未知的。我们已经使用双功能肽，其具有与LDL受体结合结构域连接到一个18个氨基酸的两亲性-螺旋先前生成的合成纳米LDL26其中目标上的GBM细胞系中的低密度脂蛋白受体。我们目前的做法是，以确定是否nLDL可以将脂溶性药物的有效载荷，如果这种药物运载工具可以杀死GBM细胞系。紫杉醇油酸盐，紫杉醇的亲脂衍生物，被用来作为模型药物。紫杉醇促进微管蛋白的聚合。形成在紫杉醇的存在下，微管是非常稳定和功能失调，从而引起细胞死亡通过破坏所需的细胞分裂的正常微管动力学。紫杉醇已证明在原发性上皮性卵巢癌，乳腺癌，结肠癌，头颈部，非小细胞肺癌，与艾滋病相关的卡波氏肉瘤的治疗抗癌活性28。虽然紫杉醇表明承诺在为胶质母细胞瘤的临床前研究，它是无效的在全身输送应用2和42。这些问题都与紫杉醇的溶解性差并且它无法穿过血-脑屏障相关联43。直接配送方式，如对流增强交付，表明承诺在提高药物的有效性在脑肿瘤44，但紫杉醇治疗是通过药物的毒性仍然仅限于健康组织。尽管我们的制剂的nLDL-PO是对HeLa细胞的毒性较低（IC50：700纳米，72小时）比标准的Cremophor EL：乙醇紫杉醇制剂（IC50：50纳米，48小时）27，nLDL-PO中与直接交付方式组合可能导致药物在脑肿瘤细胞的高与积累，因为它的目标是优先表达于GBM细胞的低密度脂蛋白受体的能力，周围的健康组织减少损伤。目前的研究已经证明加载脂溶性药物到nLDL的可行性，并表明，该递送载体可以杀死GBM细胞。紫杉醇的毒性，但是，依赖于细胞的分裂和许多细胞在不断增长的脑瘤不积极分裂45，46和47。因此，紫杉醇可能不是最佳的药物治疗这些肿瘤。细胞毒性药物，而非细胞周期依赖性可能为靶向药物递送载体更好的有效载荷。在这方面，亲水性药物可以通过化学修饰的建议转化为疏水性药物前体由几个实验室15，16和27，从而增加了药物可以通过nLDL被潜在地靶向GBM的军火库。紫杉醇油酸盐，最初是由伦德伯格等人描述。27，被掺入到脂质乳剂。类似的方法被用来罗德里格斯等人48。这一提法被认为是获得载脂蛋白E（apoE基因），其中结合的LDL受体。然而，载脂蛋白E另外结合到低密度脂蛋白受体相关蛋白（LRP），这是由神经元在整个大脑表达49。因此，这种制剂，不同于我们的粒子，没有特别的靶向肿瘤细胞，并可能会导致大量的正常脑组织的非特异性摄取和不良的副作用。在目前的研究中，我们已经表明，nLDL保留了其对目标LDLR能力，尽管加入紫杉醇油酸酯的制剂。我们观察到在IC中的高原506和12小时的温育与nLDL-PO之间的值。这一结果与我们以前的研究相一致26，其中荧光标记nLDL吸收在6小时时间点饱和。摄取的这种饱和指示的受体介导的过程。的低密度脂蛋白受体抑制剂，苏拉明，由Schneider等所示的存在31由低密度脂蛋白受体阻断LDL摄取，显著随nLDL-PO验证需要的官能LDLR的高效细胞治疗的SF-767细胞的细胞存活杀戮。这些结果与我们以前的研究相一致26，其中荧光标记nLDL针对性的低密度脂蛋白受体和吸收阻断苏拉明。在这些研究中，我们也能证明nLDL可以阻止血浆来源的LDL结合，并通过低密度脂蛋白受体摄取，进一步证实了nLDL通过低密度脂蛋白受体进入细胞。由于nLDL-PO目前的研究显示，以行为类似于nLDL没有药物，这是一个迹象表明，尽管另外的药物，nLDL保留对目标LDLR的能力。低密度脂蛋白受体的在我们的研究中测试的GBM细胞株数量从128,000至950,000元细胞，其中SF-763细胞，其中有受体的人数最多，展出最贫穷的细胞存活与它的高受体的数量一致。在U-251细胞系与受体128,000每个细胞和SF-767与288,000感受器每个细胞拥有相等的生存和生存期大于SF-763细胞。这些结果与我们以前的研究，我们注意到的是摄取荧光标记nLDL颗粒是依赖于低密度脂蛋白受体的数量在细胞表面的对比26。细胞杀死，但是，是与其它因素，如细 胞对药物和药物抗性转运蛋白，可以从细胞中除去药物的敏感性的药物既吸收的功能;因此，它是不足为奇的细胞存活率为不完全依赖于低密度脂蛋白受体数目。血浆LDL和HDL颗粒不会在脑脊髓液中发现5和50，因为它们不穿过血-脑屏障。全身递送nLDL的将限制微粒的有效分配，但是该颗粒可以通过对流增强的递送技术直接作用于肿瘤的区域被传递37。与我们的双功能肽形成nLDL颗粒小（8-15纳米），因此它很可能是它们的扩散会比血浆LDL（25纳米）或由伦德伯格描述的50nm的颗粒更优化的27，由于存在颗粒尺寸及其在组织中的扩散之间的反比关系。与直接注入大脑脂质体的研究在体内51和52，间隙时间可短至数小时，长则数天。目前的研究表明，缩短培养时间与nLDL-PO到几个小时，而不是天，将导致在培养细胞的杀伤细胞。后者表明，nLDL-PO可能是一种有效的运载工具无论过关时间发生在体内。合成nLDL因而似乎是一个有前途的药物传递载体靶向亲脂性抗癌药物对GBM。合成nLDL技术不限于GBM疗法。提高低密度脂蛋白的要求和受体活性已被观察到在结肠癌53，前列腺癌54，肾上腺肿瘤55，激素反应迟钝乳腺肿瘤56，妇科起源的癌症57，肺肿瘤组织58和白血病59和60。虽然投机，这些癌症都可能是nLDL装有化疗药物治疗。此外，LDL受体已在增殖的内皮细胞中观察到61。抗血管生成剂可以靶向使用nLDL防止肿瘤生长的内皮细胞。可替换地，用于治疗组织损伤以下损伤或手术，治疗促进伤口愈合可以加载到nLDL到目标血管内皮细胞。总之，合成nLDL似乎是一个有前途的药物传递载体通过低密度脂蛋白受体靶向治疗药物的亲脂性细胞。致谢作者要感谢儿子何和Terren特洛特为这个项目提供技术援助，并埃莉诺布莱克利博士利用她的细胞培养设施和荧光显微镜。这项研究是由儿童医院奥克兰研究所机构性基金的支持。参考文献1.o 1o 答：那拉亚那，SA利贝尔o SA利贝尔，TL菲利普斯（合编），放射肿瘤学，爱思唯尔公司，费城，宾夕法尼亚（2004）的教科书，页463-495o2.o 2o JM马克特，VT德维塔，S.赫尔曼，SA罗森伯格o 胶质母细胞瘤o 琼斯和巴特利特出版社，波士顿，马萨诸塞（2005）o3.o 3o P. 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