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业务专题报告(二)对棉花育种分子标记实验的探讨专业:农学专业年级:农学09-(1)班学生姓名:田景荣利用分子标记技术对棉花群体后代遗传分析摘要：以海岛棉和陆地棉杂交后代F5群体为研究材料，通过遗传分析和SSR分子标记探讨棉花长绒基因的遗传规律。结果表明，长绒棉纤维基因通过海岛棉和陆地棉多代回交，该基因的相关改性状在陆地棉品种上表现出来。陆地棉纤维长度接近海岛棉纤维。关键词：SSR； 分子标记； 海岛棉； 陆地棉；前言棉花是世界上最重要的天然纤维物质，棉纤维是重要的纺织工业原料，绝大多数商品棉由四倍体栽种陆地棉和海岛棉生产，其中陆地棉占90%以上。随着纺织技术的改进及人民生活水平的提高，对棉纤维的品质要求越来越高。如何提高陆地棉产量同时，迅速改良棉纤维品质，培育出大面积播种的高品质棉花品种，是大多数棉花研究者的目标，也是广大人民的期望。棉花的一些重要农艺性状如产量、品质等表现为数量遗传特点，不仅易受外界条件的影响，且还存在遗传负相关，因此常常导致选种工作量大、选择效率低（殷剑美，2002;郭旺珍和张天真，2003）【1-2】借助分子标记对目标性状的基因型进行选择减少来自同一位点不同等位基因或不同位点的非等位基因间的干扰，加速回交育种的进程，这是分子标记在棉花育种中应用的最主要方面（殷剑美，2002）。【3】目前我国棉花纤维质量可以满足纺织工业纺中、低档棉纱的要求，但可纺高档棉纱的原棉纤维所占比例较少【4】。中国棉花品质比较差，甚至与美国原棉品质有较大差距。万少安等认为这种认识上的偏差主要是我国原棉“同质性”、“一致性”差及商品棉品质下降引起的【5】。本文通过对海岛棉与陆地棉杂交的第5代棉花作物群体进行SSR 多态性片段分子标记筛选结果进行相关的分析，研究长绒棉纤维基因是否从海岛棉转导到了陆地棉上面。1 材料及方法11材料1.1.1 供试材料陆地棉和海岛棉杂交后和陆地棉回交的后代群体1.1.2 仪器设备及耗材1）PCR扩增仪2）高速冷冻离心机，最大离心力12000 rpm3）电泳仪4）短板垂直电泳槽及配套的灌胶附件5）微量移液器：规格分别为10L、20L、100L、200L、1000L6）低温冰箱：最低温度-707）高压灭菌锅：120，28）恒温水浴锅：温控精确度19）离心管10）天平：分度值0.01 g11）制冰机1.1.3 试剂及溶液1）液氮2）无水乙醇3）N，N，N，N-四甲基乙二胺（TEMED）。4）四种脱氧核苷酸（dATP、dGTP、dCTP、dTTP），缩略为dNTPs5）Taq DNA 聚合酶6）1 moL/L Tris-HCL（PH 8.0）：称取Tris碱121 g，加800mL双蒸水溶解，用浓HCL调PH到8.0后，定容到1000 mL，灭菌，室温贮存7）0.5 moL/L EDTA（PH 8.0）：称取EDTA 186.1 g，加800 mL双蒸水溶解，用NaOH调PH到8.0后，定容到1000 mL，灭菌，室温贮存8）乙醇：70%（V/V）9）10%过硫酸铵溶液：10%（m/V）过硫酸铵，4，保存期7天10）30%聚丙烯酰胺（交联度5%）：28.5 g的丙烯酰胺，1.5 g甲叉双丙烯酰胺，加重蒸馏水60 mL，37溶解后定容至100mL。11）5Tris硼酸电泳缓冲液（5TBE）：450 mmoL/L Tris-硼酸，10 mmoL/L EDTA（pH 8.0）12）加样缓冲液A：80%（m/V）去离子甲酰胺，10 mmoL/L EDTA，1 mg/mL溴酚兰，1 mg/mL二甲苯氰FF。15）银染固定液：其中含10%（V/V）乙醇和0.5%（V/V）冰乙酸。17）显影液：其中含1.5%（m/V）NaOH和0.4%（V/V）甲醛，即用即配。19）DNA标准分子量标记。20）染色液：0.2%AgNO3，即用即配。室温避光保存。1.2 试验方法1.2.1 棉花叶片的采集 采集BC5代棉花植株叶片进行检测，采取的时候尽量采上部的嫩叶。将采集的叶片用锡箔纸包好，做好标签，立即放入液氮罐中保存。1.2.2 棉花总DNA的提取孙志栋等【7】对提取棉花基因组DNA的CTAB法和SDS法及相应的改进进行的研究表明DNA的提取得率与提取方法和取材部位有关。叶磊等【8】为防止棉酚的氧化作用对棉花总DNA提取的方法进行了操作和试剂两方面的改进，从而使提取的DNA能很好地进行SSR-PCR的分析。1）取0.1g叶片置于研钵中加液氮研磨粉末状装管（2.0mL EP）2）加0.7L DNA提取缓冲液1振荡混匀 12 000 rpm 4离心5 min 倒掉上清液留沉淀。3）加入0.7mL DNA提取缓冲液2 振荡混匀至完全悬浮液保证无絮状沉淀，将EP管置于65水浴中30-40分钟，每个1min 将EP管颠倒混匀。4）时间到后待溶液冷却，加700L 酚：氯仿（1:1）振荡混匀，室温静置10 min，室温12 000 rpm离心15min。5）吸取上清液至新的EP管中加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1）振荡混匀，12 000室温离心 15 min。6） 吸取上清液至新的EP管中加入0.8倍体积异丙醇在-20放置11.5 h。取出在12 000 rpm 离心10min。7）倒掉上清液用7乙醇洗涤沉淀（0.5mL）12 000 rpm 离心5 min 倒掉上清液短暂离心后取残夜干燥沉淀。8）加入30L TE（ph 8.0）或灭菌ddH2O 充分溶解沉淀待DNA 完全溶解后将DNA样品置于-20下保存。注意事项:(1)叶片研磨成粉末后，立即装入7mL离心管中迅速加入提取液。由于棉花中富含棉酚等酚类物质，而这些物质容易自动氧化，跟蛋白质、核酸等发生不可逆反应，结果形成棕色胶状复合物，从而影响高质量DNA的获取。由于DNA提取液中有大量还原物质，可避免酚类物质氧化，因此，研磨后应迅速加入提取液。(2)第一次加入氯仿:异戊醇(24:l)后会不断释放出反应产生的气体，要放气，避免爆破。(3)颠倒混匀时不要太剧烈，以免DNA断裂，影响DNA的完整性。(4)真空干燥时，不要使DNA沉淀过分干燥，以免DNA变性。1.2.3 SSR 反应体系与扩增程序利用不同棉花SSR引物对陆地棉高品质进行了多态性筛选。SSR标记PCR扩增反应体系与检测。PCR反应体系及扩增程序见表1-1、1-2。 PCR反应体系为本实验室经过长期实践验证后的最佳反应体系。由于每对SSR引物具有特定的退火温度，因此扩增程序的退火温度根据不同引物实际Tm值而略有改动，其它步骤不变。表 1-1 PCR反应体系PCR反应试剂终浓度用量ddH20-10.5L10PCR buffer（含1.5mmol/Mg2+）11.5LdNTP(10mmol/L)0.5 mmol/L0.9LTaq DNA 聚合酶（5U/L）0.05 U/L0.2LForward Primer（5mol/L）0.5mol/L0.3LReverse Primer（5mol/L）0.5mol/L0.3L模板DNA(50ng/L)5.0ng/L1L表1-2 PCR扩增程序步骤作用温度时间Step 1预变性953minStep 2变性9445sStep 3退火55-6045sStep 4延伸7245sStep 5循环30cycleStep 6延伸725minStep 7保存4至取出注：退火温度根据引物的Tm值变化1.2.4 PAGE电泳检测1）10%非变性电泳采用DYY-III型短板电泳槽进行电泳检测，取洁净的制胶玻璃板安放到胶框上，用1%的琼脂封口，待琼脂凝固后安放至电泳槽架上，保持水平，拧紧螺栓。取100mL的烧杯，按下面的顺序配胶(表1-3)。表1-3 聚丙烯酰胺凝胶配制溶液比例溶液体积数6%聚丙烯酰胺10.8mL5TBE28.3mL10%AP720LTEMED28.2mLddH2O-2）充分混匀后，立即灌胶，及时插入梳齿。待凝胶凝固后，加入1TBE电泳缓冲液于电泳槽中，轻轻拔去梳齿，100V预电泳20分钟。3）加样：取PCR产物10L，加2L加样缓冲液充分混匀后，加样2L。4）电泳：250V电泳2-3小时（待二甲苯青FF迁移到底部即可），关闭电源，取出胶板。5）银染轻取下凝胶浸入固定液，置于摇床上轻摇12分钟，将固定液倒出加入新配制的染色液，摇动12分钟，倒出染色液，用重蒸馏水轻摇漂洗再加1%硫代硫酸钠60L于重蒸馏水中漂洗一次，倒去洗液，加入新配制的显影液，轻轻摇动直至显出清晰的条带。6）在IS9000扫描仪下观察、保存图像并记录结果。82 结果及分析2.1 与棉绒长度有关的SSR标记对BC5代的筛选纤维长度：纤维长度是指上半部平均长度，即二分之一长度(亦称中位数)以上部分纤维的平均长度。可理解为棉纤维分布中纤维平均长度以上的所有纤维的长度平均值。相当于手扯长度。世界棉花按纤维长度可分为短绒棉、中绒棉、中长绒棉、长绒棉和超级长绒棉。纤维长度因种和品种不同有很大差异。 选择分布与棉花12条染色体上的2对SSR引物，对48个棉花亲本DNA进行PCR扩增、非变形聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，出现以下几种情况：(1)有些引物没有扩增出任何条带；（2）有些引物扩增结果不完整，部分品种有条带，部分没有出现条带；（3）有些引物扩增结果较为理想，每个品种都能够扩增出目标条带，并且容易辨别多态性。选取扩增结果较好的2个引物，这些引物基本覆盖棉花的整个染色体组，共扩增出221条带，其中多态性条带192个，占整个条带数的86.9%。图 2-1 SSR标记（SBNL3257）在BC5F5群体中的分离注：M：标准分子量DNA;；P1 ：陆地棉；P2：海岛棉；F5：BC5代群体 1-45：F5单株2.2与纤维强力有关的SSR标记对BC5代的筛选纤维强度：即断裂比强度是棉花纤维试样受到拉伸直至断裂时，纤维的长度与纤维正常伸展长度的比值。表明棉纤维抵抗拉伸的能力。图 2-2 SSR标记（SBNL3257）在BC5F5群体中的分离注：M：标准分子量DNA;；P1 ：陆地棉；P2：海岛棉；F5：BC5代群体 1-45：F5单株用SBNL3257,LBNL1414,标记分别对两个组合的BC5F5代分离群体504个单株进行检测筛选，结果经SBNL3257筛选后，有标记的个体单株有187个，无标记的个体单株有317个;经LBNL1414筛选后，有标记的个体单株有64个，无标记的个体单株有440个。通过对两个组合的BC5F5代分离群体307个单株的纤维强度进行统计分析，其大小频率分布大体成正态分布，纤维强度进行“单变量数值数据”分析，纤维强度平均值为28.57 c Ntex-1，标准差2.76。对实验结果进行t分布的方差检验(表2-3)。经SBNL3257筛选后，98个有标记个体的平均纤维强度为29.74 c Ntex-1,209个无标记个体的平均纤维强度为28.03 c Ntex-1，两者相差l.71cNtex-1，达极显著水平;经LBNL1414筛选后，40个有标记个体的平均纤维强度为29. 38 cNtex-1,267个无标记个体的平均纤维强度为28.45 cNtex-1，两者相差0.93 cNtex-1，达显著水平。这证明了利用与主效QTL紧密连锁的分子标记进行棉花辅助选择育种的效果是显著的，同时也证明了标记SBNL3257与LBNL1414是紧密连锁的。表2-3 各标记基因型单株的纤维强度分析结果标记基因型单株/个平均比强度/( cNtex-1)差数方差TPSBNL3527+-982092974280317181165250652510-7LBNL1414+-4026729382845093638734213001注：+：有标记的基因型；-：无标记的基因型3 讨论3.1 SSR对特征基因的检测本实验在利用单对SSR 特异引物进行杂交种纯度鉴定的基础上（易成新，1999）【9】,又利用筛出的特异SSR 引物,特异性的SSR印、引物在我们的实验样品中得到了多条相关的特异性条带，说明BC5代群体已经带有相关的长绒棉基因。3.2 QTL的稳定性和SSR标记辅组育种效果以海岛棉和陆地棉为亲本杂交以及多代回交不同组合不同世代都检测到了LBNL1414、SBNL3257标记的QTL，有无标记的单株个体的平均纤维强度的差异都达到了显著差异。证明了此QTL在不同的遗传背景、不同的分离世代、不同的生态环境中均能表达。这和沈新莲等（2001）【10】以泗棉3号为主要遗传背景的回交群体验证是一致的。4 结论本研究选用陆地棉优质品种作为亲本。共利用5518对SSR引物筛选海岛棉和陆地棉的差异，获得216对多态性引物，多态性引物占40，陆地棉和海岛棉所构建群体，DNA标记多态性较好，可有效用于遗传图谱构建。同时，可以利用本次研究结果作为原材料来进行育种分析，运用逆转录等方法获得目的基因进行转基因，最终获得人们希望的品种。参考文献：1殷剑美，2002，陆地棉产量和品质性状的遗传及分子标记研究 硕士学位论文 南京农业大学，pp:12-152张天真,郭旺珍，2003，棉花基因组育种现状与展望J.棉花学报，15（5）：298-3033唐淑荣，盂俊婷，褚平等我国棉花纤维品质现状分析江西农业学报20074万少安，任琪，中外棉花纤维品质比较分析http：/5中国农业科学院棉花研究所中国棉花遗传育种学山东科学技术出版