微生物工程工艺原理.doc

1、 根据微生物对温度的依赖可分为几类？答：嗜冷菌：0260C生长，嗜温菌：15430C生长，嗜热菌：37650C生长，嗜高温菌：650C生长 。2、 微生物对温度要求不同的原理是什么？答：（1）微生物对温度的要求不同与它们的膜结构物理化学性质有密切关系根据细胞膜的液体镶嵌模型，细胞在正常生理条件下，膜中的脂质成分应保持液晶状态，只有当细胞膜处于液晶状态，才能维持细胞的正常生理功能，使细胞处于最佳生长状态，微生物的生长温度与细胞膜的液晶温度范围相一致。根据细胞膜脂质成分分析表明，不同最适温度生长的微生物，其膜内磷脂组成有很大区别。嗜热菌只含饱和脂肪酸，而嗜冷菌含有较高的不饱和脂肪酸。（2）蛋白质结构：通过对嗜冷酶的蛋白质模型和x一射线衍射分析表明，嗜冷酶分子间的作用力减弱，与溶剂的作用加强，酶结构的柔韧性增加，使酶在低温下容易被底物诱导产生催化作用（3）蛋白质合成：嗜冷菌具有在0合成蛋白质的能力。这是由于其核糖体、酶类以及细胞中的可溶性因子等对低温的适应，蛋白质翻译的错误率最低。许多中温菌不能在O0C合成蛋白质，一方面是由于其核糖体对低温的不适应，翻译过程中不能形成有效的起始复合物，另一方面是由于低温下细胞膜的破坏导致氨基酸等内容物的泄露。（4）合成冷休克蛋白：低温微生物适应低温的另一机制是合成冷休克蛋白将大肠杆菌从370C突然转移到100C条件时细胞中会诱导合成一组冷休克蛋白，它们对低温的生理适应过程中发挥着重要作用，检测嗜冷酵母的冷休克反应，发现冷刺激后冷休克蛋白在很短时间内大量产生。耐冷菌由于生活在温度波动的环境中，它们必须忍受温度的快速降低，这与它们产生的冷休克蛋白是密切相关的。3、 发酵过程的温度会不会变化？为什么？答：会变化，发酵热引起发酵液的温度变化的原因，发酵热就是发酵过程中释放出来的净热量，什么叫净热量呢？在发酵过程中产生菌分解基质产生热量、机械搅拌产生热量、通气热，而罐壁散热、水分蒸发、空气排气带走热量。这各种产生的热量和各种散失的热量的代数和就叫做净热量，发酵热引起发酵液的温度上升。发酵热大，温度上升快；发酵热小，温度上升慢。4、 发酵热的定义答：发酵过程中，由于菌体对培养基的利用而发生的反应及搅拌时产生的摩擦等等，都会产生一定的热量、水分的蒸发等也带走了一部分热量，发酵过程中释放出来的净热量称为发酵热。5、生物热的大小与哪些因素有关？答：发酵类型、培养时间、菌数、呼吸作用强度。6、 温度对发酵有哪些影响？答：（1)温度可直接影响发酵过程中的各种反应速率；（2）通过改变发酵液的物理性质，间接影响产物的形成：（3）温度还会影响生物合成的方向；（4）温度对代谢有调节作用。7、 发酵过程温度的选择有什么依据？答：（1）根据菌种及生长阶段选择 微生物种类不同，所具有的酶系及其性质不同，所要求的温度范围也不同。如黑曲霉生长温度为370C，谷氨酸产生菌棒状杆菌的生长温度为30320C，青霉菌生长温度为300C在发酵前期由于菌量少，发酵目的是要尽快达到大量的菌体，取稍高的温度，促使菌的呼吸与代谢，使菌生长迅速；在中期菌量已达到合成产物的最适量，发酵需要延长中期，从而提高产量，因此中期温度要稍低一些，可以推迟衰老。因为在稍低温度下氨基酸合成蛋白质和核酸的正常途径关闭得比较严密有利于产物合成。发酵后期，产物合成能力降低，延长发酵周期没有必要，就又提高温度，刺激产物合成到放罐。（2） 根据培养条件选择 温度选择还要根据培养条件综合考虑，灵活选择。通气条件差时可适当降低温度，使菌呼吸速率降低些，溶氧浓度也可髙些。培养基稀薄时，温度也该低些。因根据菌生长情况（3） 菌生长快，维持在较高温度时间要短些；菌生长慢，维持较高温度时间可长些。培养条件适宜，如营养丰富，通气能满足，那么前期温度可髙些，以利于菌的生长。总的来说，温度的选择根据菌种生长阶段及培养条件综合考虑。8、 发酵过程中PH会不会发生变化，为什么？答：发酵过程中pH是不断变化的1）糖代谢:特别是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使pH下降。糖缺乏，pH上升，是补料的标志之一； 2）氮代谢:当氨基酸中的-NH2被利用后pH会下降；尿素被分解成NH3，pH上升，NH3利用后pH下降，当碳源不足时氮源当碳源利用pH上升； 3）生理酸碱性物质利用后pH会上升或下降； 4）某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液pH变化。如有机酸类产生使pH下降，红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性，使pH上升； 5）菌体自溶 pH上升，发酵后期，pH上升； 6）杂菌的污染，pH下降9、pH对发酵的影响表现在哪些方面？答：（1）pH影响酶的活性。当pH值抑制菌体某些酶的活性时使菌的新陈代谢受阻。（2）pH影响微生物细胞膜所带电荷。从而改变细胞膜的透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢物的排泄，因此影响新陈代谢的进行。（3）pH值影响培养基某些成分和中间代谢物的解离，从而影响微生物对这些物质的利用。（4）pH值影响代谢方向。pH不同，往往引起菌体代谢过程不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。例如黑曲霉在pH23时发酵产生柠檬酸，在pH近中性时，则产生草酸。谷氨酸发酵，在中性和微碱性条件下积累谷氨酸，在酸性条件下则容易形成谷氨酰胺和N-乙酰谷氨酰胺。（5）pH在微生物培养的不同阶段有不同的影响。10、为了确定发酵的最佳pH，我们该如何实验？答：配制不同初始pH的培养基，摇瓶考察发酵情况 11、 发酵过程的pH控制可以采取哪些措施？答：（1）、调节好基础料的初始pH （2）、在基础料中加入维持pH的物质 （3）、通过补料调节pH （4）、当补料与调pH发生矛盾时，加酸碱调pH（5）、发酵的不同阶段采取不同的pH值 。12、 染菌对发酵有什么危害，对提炼有什么危害？答：染菌对发酵的危害：造成大量原材料的浪费，在经济上造成巨大损失扰乱生产秩序，破坏生产计划 遇到连续染菌，特别在找不到染菌原因往往会影响人们的情绪和生产积极性影响产品外观及内在质量染菌对提炼的危害：染菌的发酵液一般发粘，过滤困难。染菌发酵液中含有比正常发酵液更多的水溶性蛋白和其他杂质，比较难于进一步提炼。采用有机溶剂萃取的提炼工艺，则极易发生乳化，很难使水相和溶剂相分离，影响进一步提纯。采用直接用离子交换树脂的提取工艺，如链霉素、庆大霉素，染菌后大量杂菌黏附在离子交换树脂表面，或被离子交换树脂吸附，大大降低离子交换树脂的交换容量，而且有的杂菌很难用水冲洗干净，洗脱时与产物一起进入洗脱液，影响进一步提纯。13、 有哪些原因会引起染菌？答：设备渗漏、空气带菌、种子带菌、灭菌不彻底、技术管理不善、操作失误等。14、 染菌以后应采取什么措施？答：1） 染菌后的培养基必须灭菌后才可放入下水道 2） 凡染菌的罐要找染菌的原因，对症下药，该罐也要彻底清洗，空罐消毒，才可进罐。 3） 染菌厉害时，车间环境要用石灰消毒，空气用甲醛熏蒸，特别，若染噬菌体，空气必须用甲醛蒸汽消毒。 4） 前期：严重的重新灭菌，轻微的控制条件提高生产菌的相对生长优势（温度，pH，通气） 5） 中期：危害大，营养消耗快，pH变化大，菌丝自溶厉害，产物分泌减少或停滞。重新灭菌、提前、倒灌 6） 后期：危害小，坚持或提前放罐15、为什么会感染噬菌体？感染了噬菌体后应采取哪些措施？答：1生产菌株本身可能就是带有前噬菌体的污染菌，在发酵过程，如遇到某些条件个别菌体就会自发的进入裂解性生活周期，而产生噬菌体。2发酵液中存在噬菌体，究其来源有：（1）含有噬菌体的发酵罐会通过排气、测样废液、洗罐污水或偶尔的“跑液”等大量散布噬菌体，污染发酵环境和生产系统的各环节。（2）滤过装置不良、失效或处理不确实，并在环境中有噬菌体的情况下造成污染。（3）操作人员导致的污染。通过工作人员沾有噬菌体的手、工作服及所用器具导致噬菌体污染。（4）有时因噬菌体变异，使原本抗噬菌体的菌株变成敏感菌株，导致新的污染。如已感染噬菌体可采用以下措施：1)选育抗性菌株，及时改用抗噬菌体的生产菌株。2)轮换使用专一性不同的菌株。3)加化学药物(如谷氨酸发酵可加2-4ppm氯霉素，0.1%三聚磷酸钠，0.6%柠檬酸钠或铵等)。4)将培养液重新灭菌再接种(噬菌体不耐热，70-80经5分钟即可杀死)。5）尽快提取成品16、 用于在线检测的传感器必须符合哪些要求？答：（1）必须经受高压蒸汽灭菌（材料、数据）;（2)结构不存在灭菌死角（密封性好）（3） 对测量参数要敏感，且能转换成电信号（响应快，灵敏）；（4） 性能要稳定，受气泡影响小17、 PH电极的指示电极能测定pH值的原理是什么？答18、 pH电极的测量范围有没有限制？使用时应注意哪些问题？答：有，pH电极中，Na离子为干扰离子，在pH超过10或Na离子较高时测定的pH会有偏差 使用注意：玻璃电极切勿倒置，也不要用手接触电极的敏感膜；不要用手接触需要高度绝缘的端子和接线头19、溶氧电极能够测定液体中溶氧浓度的原理是什么？答：20、 影响溶氧电极测定的灵敏度和准确性的因素有哪些？答：灵敏度：增加膜穿透系数P ；减少膜厚度D；增加阴极表面积；扩散速度；搅拌速度； 通气量；培养液粘度准确性：电极灵敏度；温度（1）.压力和温度的影响：溶氧电极必须经得起高压蒸汽灭菌，如能耐130摄氏度，1小时灭菌和具有长期的稳定性，其漂移不大于1%/d，其精确度和准确度在+3%。（2）.原电池型电极电流输出受电极表面液流的影响。（3.）用溶氧电极测定呼吸临界氧值时，过程中先加强通气搅拌，使溶氧上升到最高值，然后中止通气，继续搅拌，在灌顶部空间充氮。这时溶氧会迅速直线下降，直到其直线斜率开始减少时所处的溶氧值便是呼吸临界氧值。21、哪些仪器可以测定尾气氧和尾气二氧化碳？测定原理是什么？答： 尾气CO2的测量 常用的尾气测定仪是不分光红外线二氧化碳测定仪（简称IR），其精度高，可达 0.5%，量程的线性范围大，虽然仪器价格高，但在生物细胞培养时常被采用。 不分光红外线CO2气体分析原理是：除了单原子气体（如氖、氩等）和无极性的双原子气体（如氧、氢、氮等）外，几乎所有气体都在红外波段（即微米级）具有不同的红外吸收光谱，CO2的红外吸收峰在2.62.9m和4.14.5m之间有两个吸收峰，根据吸收峰值可以求出CO2的所含浓度尾气氧气测定 原理是氧具有高顺磁性。在磁场中，氧气的磁化率比其采用热磁氧分析仪测定 它气体高几百倍，故混合气体的磁化率几乎完全取决于含氧气的多少。将排气通入热磁氧分析仪，就可测出排气氧的含量。22、 泡沫对发酵有哪些有益之处，哪些有害之处？答：危害：（1)降低生产能力 在发酵罐中，为了容纳泡沫，防止溢出而降低装量（2）引起原料浪费 如果设备容积不能留有容纳泡沫的余地，气泡会引起原料流失，造成浪费。（3）影响菌的呼吸 如果气泡稳定，不破碎，那么随着微生物的呼吸，气泡中充满二氧化碳，而且又不能与空气中氧进行交换，这样就影响了菌的呼吸。 （4）引起染菌 由于泡沫增多而引起逃液，于是在排气管中粘上培养基，就会长菌。随着时间延长，杂菌会长入发酵罐而造成染菌。大量泡沫由罐顶进一步渗到轴封，轴封处的润滑油可起点消泡作用，从轴封处落下的泡沫往往引起杂菌污染。有利之处：气体分散、增加气液接触面积。23、 发酵中泡沫形成的原因是什么？答：(1)通气搅拌的强烈程度 通气大、搅拌强烈可使泡沫增多，因此在发酵前期由于培养基营养成分消耗少，培养基成分丰富，易起泡。应先开小通气量，再逐步加大。搅拌转速也如此。也可在基础料中加入消泡剂。（2）培养基配比与原料组成 培养基营养丰富，黏度大，产生泡沫多而持久，前期难开搅拌。（3）菌种、种子质量和接种量 菌种质量好，生长速度快，可溶性氮源较快被利用，泡沫产生几率也就少。菌种生长慢的可以加大接种量（4）灭菌质量 培养基灭菌质量不好，糖氮被破坏，抑制微生物生长，使种子菌丝自溶，产生大量泡沫，加消泡剂也无效。24、 没有外界作用力泡沫是否稳定？在什么条件下泡沫会稳定？答：不稳定：泡沫是热力学不稳定体系泡沫体系的三阶段变化：(1) 气泡大小分布的变化半径越小气泡压力越大(2) 气泡液膜变薄泡沫液还比较厚，以后因蒸发排液而变薄，泡沫液会受重力的影响向下排液，泡沫液随时间延续而变薄(3) 泡沫破灭泡沫由于排液，液量过少，表面张力降低，液膜会急剧变薄，最后液膜会变得十分脆弱，以至分子的热运动都可以引起气泡破裂。因此只要泡沫液变薄到一定程度，泡沫即瞬间破灭在泡沫直径小，表面张力小，具有吉布斯弹性，助泡剂浓度大，粘稠的液体中稳定25、罗氏假说对泡沫稳定的条件作了如何假释？答：在溶液中，溶解状态的溶质是稳泡剂；不溶状态的溶质，当浸入系数与铺展系数均为正值时即是消泡剂26、 植物油的消泡机理是什么？答：消泡剂作用机理有a、消泡剂可使泡沫液局部表面张力降低，因而导致泡沫破灭b、消泡剂能破坏膜弹性而导致气泡破灭 c、消泡剂能促使液膜排液，因而导致气泡破灭 d罗氏假说消泡剂根据其作用机理的不同可以分为破泡剂和抑泡剂植物油属于天然油脂是一种破泡剂。其破消泡机理大致有二种。第一，吸附助泡剂，加入电解质，瓦解双电层，及使助泡物被增溶等机理，这样就破坏助泡物的稳泡作用，同时消耗掉相应的助泡物。第二，低级醇等溶解性较大的消泡剂，加到气泡液中局部降低表面张力，发挥破泡作用，同时本身不断破为碎块，陆续溶解而失去破泡作用。破泡过程中，破泡剂不断失效、消耗，而助泡剂却不受影响。27、 对消泡剂有哪些要求？答：（1）在起泡液中不溶或难溶；（2）表面张力低于起泡液；（3）与起泡液有一定程度的亲和性；（4）与起泡液不发生化学反应；（5）挥发性小，作用时间长28、 常用的消泡剂有哪几类？答：天然油脂（酒糟榨出液/啤酒花油） 聚醚类（甘油三羟基聚醚、GP、GPE） 硅酮类（二甲基硅油） 高级醇（7C-9C醇）29、 对于黏稠的发酵液应选怎样的消泡剂，对于较稀的发酵液应选怎样的消泡剂？答：粘稠：聚氧乙烯氧丙烯甘油（GPE、泡敌）亲水性较好，溶解度大，消泡能力强较稀：聚氧丙烯甘油（GP）亲水性差，在发泡介质中溶解度小，抑泡能力强30、利用基因工程菌生产有什么优势？常用的宿主菌有哪些？答：工程菌一般都是野生菌改良过的，集合一些优良性状，可以增加发酵的终产物。常用宿主菌：大肠杆菌；G+细菌（枯草杆菌）；低等真核生物（酵母菌）；哺乳动物细胞31、 利用基因工程菌生产有哪些特点？答：（1）基因易丢失，不稳定（2）培养分两段：前期菌体生长，生长到某一阶段，加入诱导因子，诱发产物表达；(3)基因的不稳定性。32、 重组菌基因不稳定性的原因有哪些？答：（1）分离丢失；（2）结构不稳定性；（3）宿主细胞调节突变33、 在基因工程菌培养过程中为什么质粒会丢失？答：质粒