《兴奋剂检测》PPT课件.ppt

兴 奋 剂 检 测,王怀冲 主管药师 杭州市红会医院,一、兴奋剂概况,掉进“尿瓶子”的“体坛精英们”！,本约翰逊 1988年 汉城奥运会 合成类固醇类,兰迪斯 2006年 环法自行车大赛 表睾酮和睾丸激素超标,马里昂琼斯 2000年 悉尼奥运会 类固醇,孙英杰 2005年 十运会 外源性雄酮,“兴奋剂”一词源于英文词dope，原义为“供赛马使用的一种鸦片麻醉混合剂”。 兴奋剂是国际上体育界对违禁药物的总称。 国际体育组织对兴奋剂的含义作了下述规定：“健康人以特殊的目的，把药物以任何形式摄入体内，或者以不正常的方法应用非正常量的生理物质，这些在比赛中用来提高运动成绩的做法，称之为应用兴奋剂”。,兴奋剂概念,兴奋剂发展,20世纪60年代,刺激剂 麻醉剂,60年代末期,合成类固醇,促红细胞生长素,80年代,近几年,人体生长激素,出现严重的性格变化 产生药物依赖性 导致细胞和器官功能异常 产生过敏反应，损害免疫力 引起各种感染（如肝炎和艾滋病）,兴奋剂的危害,二、兴奋剂分类和方法,麻黄素,甲基苯丙胺 （冰毒）,（一）、刺激剂,大多数刺激剂的分析测定都是将色谱分离技术与灵敏的检测手段(如光谱法、电分析法)结合起来而进行定量分析。,常见苯丙胺类兴奋剂及其药理作用,吗啡,（二）、麻醉止痛剂,杜冷丁,麻醉剂的检测主要有高效液相色谱与质谱(HPLC-MS)联用、质谱与质谱(MS-MS)联用、色谱与光谱联用及电分析等方法。,（三）、合成类固醇,替勃龙,甲睾酮,色谱与质谱联用，集合了色谱的高效分离能力和质谱的结构鉴定特征。,（四）、利尿剂,氢氯噻嗪,吲达帕胺,利尿剂的检测一般要在尿样、血清等成分复杂的实际样品中进行，所以其检测必须先采用色谱、电泳等方法进行有效地分离。导数分光光度法、荧光光谱。,（五）、-阻断剂,比索洛尔,卡维地洛,分光光度法；用HPLC分离，荧光法检测；吸附溶出方波伏安法。,大多以激素的形式存在于人体 1、人体生长激素（hGH） 2、胰岛素 3、促红细胞生成素（EPO） 4、促性腺素,（六）、内源性肽类激素,免疫分析法。,又称为血液红细胞回输技术，增强血液载氧能力。1988年汉城奥运会正式被国际奥委会列入禁用范围。,（七）、血液兴奋剂,四、兴奋剂检测过程,1967年，用气相色谱法（GC）、薄层色谱法（TLC）进行分离鉴定，使用了4种GC填充柱系统，氢焰离子化检测器，可检出40种兴奋剂。 1972年，采用了程序升温方法，并用氮磷检测器检测。 1976年，使用气相色谱-质谱联用手段检测甾体。 1980年，用毛细管气相色谱法检测，至1984年大体基本定型，并增加了用高效液相色谱法检查几种特定药物及咖啡因定量等工作。 近年来，毛细管电泳、免疫测定、GC - MS - MS等技术广泛应用。,检测手段进展,检测流程图,尿检是兴奋剂检测的常规武器，主要针对传统兴奋剂和各种合成代谢类固醇。 其优点在于： 取样方便 对人无损害 尿液中的药物浓度高于血液中的药物浓度 尿液中的其他干扰少,尿样检测,分析过程中按药物的化学特征和分析方法将所有药物分成四类， 第一类：尿中以游离形式排泄的易挥发性含氮化合物（主要是刺激剂）； 第二类：尿中以硫酸或葡萄糖醛酸结合的难挥发性含氮化合物（主要是麻醉止痛剂，阻滞剂和少数刺激剂）； 第三类：化学结构和特性特殊的刺激剂（咖啡因，匹莫林）和利尿剂； 第四类：合成类固醇及睾酮。,尿样检测,尿检不足 常规尿检不仅对血红细胞生长素EPO和促生长激素HGH等禁药无能为力，即使对合成代谢类固醇的“变种”THG等物质也毫无办法。,尿样检测,血样检测的目的主要是补充尿样分析方法的不足，是针对EPO的一种检测方式。,血样检测,2000年，悉尼奥运会第一次实施EPO检测计划，把血检列为兴奋剂检测项目，成为奥林匹克反兴奋剂史上的里程碑。该计划将“EPO2000”血检法和法国科学家开发出来的尿检EPO法共同实施，血液和尿样检测同时呈阳性的运动员才会被处罚，而拒绝血检的运动员将被定为与服禁药同罪。,血样检测,“EPO2000”研究计划是澳大利亚科学家主导的一项国际合作研究。该项研究最终发现，人体内有三种物质可作为服用生长激素后的标靶物。这三种物质的体内含量有特定变化曲线，一旦异常就说明有体外摄取。按照这种检测技术，通过抽取大约10毫升的血样，便可发现运动员三周前是否注射过EPO。 法国科学家开发的是一种新型尿检法。通过分析合成EPO与自然EPO电荷上的微小差别，可检测出当事人在3天内是否接受过EPO兴奋剂注射。 悉尼奥运会期间，血检可以有效地查出EPO，但对于HGH仍然无能为力。,血样检测,HGH的作用类似于一种合成代谢类固醇，能够帮助肌肉生长并帮助运动员从训练疲劳中迅速恢复。 由于HGH也能自然生成，关键问题就是如何区分人体自然产生的HGH和人工合成的HGH。 虽然HGH早在20世纪80年代就被列为违禁药物并被怀疑大量使用，但现有的检测手段却根本无法追寻到它的踪影,血样检测,2003年10月底，国际奥委会和世界反兴奋剂机构称，已找到检测人工合成HGH的方法，并在雅典奥运会上实施。,血样检测,“猫”能捉光所有的“老鼠”吗,基因兴奋剂将成为下一代兴奋剂的“主角”，基因兴奋剂的检测将成为国际体育界面临的一个新难题，与其他兴奋剂相比，基因兴奋剂更难被检测出来。因为人为植入的基因所产生的蛋白质，与人体天然形成的蛋白质看起来完全相同。,基因兴奋剂,对载体和导入的外源性基因的检测 对基因表达后各类产物的检测 对常规生化指标的检测 困难重重 德国科隆体育学院，2009年3月表示其已开发出新的利用质谱检测基因兴奋剂的方法，该方法将从2012年伦敦奥运会开始使用。通过该方法检测出的禁药包括GW1516。,基因兴奋剂,五、兴奋剂检测实例,目的：建立RP-HPLC法测定安乃近中的4-N-去甲基安乃近。 方法：色谱柱为Agilient ODS柱（4.6 mm150 mm5m），以甲醇0.02 molL-1：磷酸二氢钾溶液（38:62）（含1.35的亚硫酸钠）（用三乙胺调pH8.1），245 nm为检测波长，流速1.0 mLmin-1，溶剂为流动相。 结果：4-N-去甲基安乃近的线性范围为0.10510.50gmL-1，平均回收率为99.59（RSD0.38），溶液在6h内稳定。 结论：本法准确、可行。,（一）、RP-HPLC法测定安乃近中的 4-N-去甲基安乃近,RP-HPLC法测定安乃近中的 4-N-去甲基安乃近,1. 亚硫酸钠（tR=1.4min） 2. 4-N-去甲基安乃近（tR=2.3min） 3. 安乃近（tR=2.6min） 4. 4-氨基安替比林（tR= 5.0min） 5. 4-甲氨基安替比林（tR=6.9min）,目的：建立反相高效液相色谱法测定红细胞作为载体的吗啡体内药物浓度 。 方法：全血样品中加人内标茶碱后用乙酸乙酯提取。色谱柱为Kromasil C18柱（150 mm4.6 mm5m）；流动相为0.1三乙胺水溶液-甲醇（85:15），用磷酸调pH为6.95；流速：1.5 mLmin-1，紫外215 nm检测 。 结果：全血中杂质不干扰样品的测定，本方法线性范围为51000 ngmL-1（r0.9996）；最低检出浓度为2 ngmL-1；提取回收率为85.3491.57，方法回收率为96.89101.4；日间和日内RSD分别为1.264.24和1.193.64。 结论：本方法简单、灵敏、准确。,（二）、RP-HPLC法测定人全血中吗啡血药浓度,RP-HPLC法测定人全血中吗啡血药浓度,空白全血A 吗啡血样B (1. 内标茶碱 2. 吗啡),目的：应用串联质谱（Cl离子源）法进行尿中氯胺酮及其代谢物的快速测定。 方法：取尿液23 mL，加入固体碳酸钠少量和丙酸酐80 L，超声5 min，加入醋酸甲酯2 mL，超声萃取l0 min后离心（4000 rmin-1）3 min，取上层有机相转入事先加入无水硫酸钠的样品瓶（4 mL容量）中，供GCMSMS测定。 结果：本方法不仅适用于尿中氯胺酮原药的检验，同时满足尿中去甲氯胺酮、脱氢去甲氯胺酮的检验，回收率达90以上，最低检出浓度为：510-8gL-1；GC-MSMS的最低检出限为0.05 ng。 结论：本方法可满足确证48 h以内是否吸食过氯胺酮。,（三）、应用GC-双质谱法快速测定尿液中氯胺酮及其代谢物,应用GC-双质谱法快速测定尿液中氯胺酮及其代谢物,目的：建立了一种简单、灵敏、快速地同时测定人体尿液中3类(刺激剂、麻醉剂和抗雌激素)5种兴奋剂的气相色谱-氮磷检测(GC-NPD)方法。 方法：尿样采用非衍生法液-液萃取预处理技术,选用叔丁基甲醚作为萃取溶剂,二苯胺作为内标进行定量检测。 结果：混合标准品中各组分不受干扰物质峰的影响，尿样中基体成分与混合标准品中的各组分得到较好的分离。 结论：此方法适合于尿样中刺激剂、麻醉剂和抗雌激素类兴奋剂的同时检测。,（四）、气相色谱-氮磷检测方法同时检测尿样中刺激剂、麻醉剂和抗雌激素类五种兴奋剂,气相色谱-氮磷检测方法同时检测尿样中 刺激剂、麻醉剂和抗雌激素类五种兴奋剂,测定海洛因的新方法： 研究了海洛因对BelousovZhabotinsky（ B-Z）振荡反应的影响，结果表明：海洛因的加入明显地改变了振荡体系的周期和振幅，即对振荡体系产生扰动，扰动的浓度范围为l.810-82.110-3molL，且海洛因的浓度分别在3.810-62.810-5molL和0.910-62.910-5molL范围内与振荡周期改变值T和振幅改变值A均呈现良好的线性关系，相关系数分别为0.9931和0.9746。结果表明：加入海洛因的浓度越大，电极电位变化值A和振荡周期变化值T越大。,（五）、应用别洛索夫扎鲍京斯基振荡化学反应的分析,应用别洛索夫扎鲍京斯基振荡化学反应的分析,目的：建立新的检测促红细胞生成素的判别函数，提高EPO血液检测方法的灵敏度和特异性。 方法：人体实验采用随机双盲对照设计，将24名受试者分为实验组和对照组，分别注射重组EPO和安慰剂。 用Advia120血液分析仪检测红细胞压积(HCT%)、网织红细胞压积(RetHCT)、巨红细胞百分数(Macro%)； 血清EPO浓度的测定采用免疫化学发光法； 可溶性转铁蛋白受体(sTfR)的测定采用酶联免疫吸附分析法。,（六）、促红细胞生成素检测的判别分析研究,结果：