贝那普利对糖尿病肾病大鼠肾脏五聚素表达及相关因素的影响叶茂.pdf

作者简介叶茂( 1975 ) ， 女， 湖北恩施人， 硕士在读， 主任医师， 研究方向: 糖尿病及慢性并发症发病机制的研究。 贝那普利对糖尿病肾病大鼠肾脏五聚素 3 表达及相关因素的影响 叶茂1， 2， 汪长华1 ， 张 敏2 1武汉大学基础医学院( 湖北 武汉 430071) 2恩施自治州中心医院( 湖北 恩施 445000) 【摘要】 目的研究糖尿病肾病( DN) 大鼠肾组织五聚素3( PTX3) 的表达情况及贝那普利对其影响。方法 33 只 雄性 Wistar 大鼠建立 DN 模型后， 随机分为 3 组: 正常对照组( NC 组) 糖尿病肾病组( DN 组) 贝那普利组( BE 组) ， 每组 11 只， BE 组给予贝那普利 10mg/( kgd) 灌胃， NC 和 DN 组以等量蒸馏水灌胃， 1 次/d， 连用 12 周， 之后 检测血糖、 糖化血红蛋白、 肾重指数、 尿微量白蛋白排泄率、 肾组织 PTX3 的表达。结果12 周末， DM 组大鼠肾组 织中 PTX3 表达明显高于 NC 组( P001) ， BE 组的表达显著低于 DM 组， 高于 NC 组( P001) ; PTX3 表达与尿白 蛋白排泄率呈正相关( r=0954， P001) 。结论PTX3 表达在糖尿病大鼠肾组织中明显增加， 抑制蛋白尿表达可 减少 PTX3 的表达。 【关键词】 糖尿病肾病; 盐酸贝那普利; 五聚素 3 【中图分类号】 5871【文献标识码】 A【文章编号】 10088164( 2016) 03001304 Effects of Benazepril Hydrochloride on the Expressions of PTX3 and elated Factors in the Kidney of DN ats Ye Mao1， 2， Wang Changhua1， Zhang Min2 ( 1Basic Medical Science School of Wuhan University， Wuhan 430071， China; 2The Central Hospital of Enshi Autonomous Prefecture， Enshi 445000， China) 【Abstract】 Objective To investigate the expressions of PTX3 in the kidney of Diabetic Nephropa- thy ( DN)rats and the effects of Benazepril Hydrochloride on them Methods After establish- ment of DN model， 33 male Wistar rats were divided randomly into 3 groups: Normal control group ( NC group) ， diabetic nephropathy group ( DN group)and Benazepril Hydrochloride group ( BE group) ， 11 rats in each group The BE group was given by lavage Benazepri， and the same volume of distilled water was lavaged to the two other groups Twelve weeks later， Blood Glu- cose， Glycosylated Hemoglobin， kidney weight index，urinary albumin excretion and the expres- sions of PTX3 were measured esults At the end of 12th week， the expressions of PTX3 in the DN group were significantly higher than those in the NC group( P0 01) and the expressions in the BE group were lower significantly than those in the DN group， but significantly higher than those in the NC group( P0 01) And the expressions of PTX3 showed a strong positive correla- tion with the level of Proteinuria( r = 0954， P0 01) Conclusion In the renal tissue of Diabetic rats， the expressions of PTX3 significantly increased， and inhibiting the expressions of Proteinu- ria can decrease the expressions of PTX3 【Key words】 diabetic nephropathy; benazepril nephropathy; PTX3 Katherine1 提出把糖尿病肾病 ( diabetic ne-phropathy， DN) 看作一种由代谢紊乱引起的炎症性 第 33 卷第 3 期( 第 13 页) 2016 年 湖北民族学院学报医学版 Journal of Hubei University for NationalitiesMedical Edition Vol33 No3 P13 2016 DOI:10.13501/ki.42-1590/r.2016.03.005 疾病。五聚素3( pentraxin3， PTX3) 又叫肿瘤坏死 因子刺激基因 14 ( tumornecrosis factor stimulated gene 14， TSG14) 2 ， 是一种急性期糖蛋白可溶性受 体， 通常扮演着调理素的角色。PTX3 在血管内皮 细胞和巨噬细胞上表达， 因此它的水平可更加直接 反映血管炎性状态。临床研究表明 34 PTX3 水平 的增加与心血管事件、 慢性肾脏疾病相关。微量蛋 白尿是 DN 最早的临床检验异常指标， 同时也是内 皮功能障碍与高循环炎症介质的强预测因子。尿蛋 白的丢失程度预测显性肾病的进展速度。贝那普利 为血管紧张素转换酶抑制剂， 具有抗炎症和抗纤维 化作用， 对 DN 有良好的疗效 4 ， 广泛应用于临床。 本研究旨在探讨贝那普利对糖尿病大鼠肾组织 PTX3 以及尿蛋白排泄率等的影响， 为 DN 治疗、 新 药开发提供实验依据， 现报道如下。 1材料与方法 11动物模型建立与分组6 周龄清洁级 Wistar 雄性大鼠( 湖北省实验动物研究中心提供) 随机分 为 3 组: 正常对照组( NC 组) ， 糖尿病肾病组( DN 组) ， 贝那普利组( BE 组) 。体质量( 1909) g， 每组 11 只。按昼夜时程平衡饲料喂养， 自由饮水， 进食， 经1 周喂养适应后， 测定血糖均正常。禁食12h 后， DN 组和 BE 组一次性腹腔注射链脲佐菌素( STZ) 60mg/kg， 造糖尿病肾病模型， 72 h 后， 鼠尾静脉采 血测血糖167 mmol/L 为建模成功， NC 组用等量 的柠檬酸缓冲液， 给药方式相同， 建模成功后的 BE 组大鼠给予盐酸贝那普利( 北京诺华制药有限公 司， 10mg/片， 批号20030514) 混悬液以10mg/( kg d) 比例灌胃， 每日 1 次， 连用 12 周。NC 组和 DM 组 每天则给予等剂量蒸馏水灌胃。 12标本留取与测定12 周末， 处理前一天代谢笼 收集 24 h 尿， 检测尿微量白蛋白( 广州丰华公司泰 莱型时间分辨荧光免疫分析仪) ， 计算尿白蛋白 排泄率( 尿微量白蛋白尿量/2460， UAE) 。空腹 12h 后， 称重后给予 10%水合氯醛( 07 mg/kg) 腹腔 注射麻醉， 快速心脏采血约 2 mL， 置于抗凝管检测 血糖、 糖化血红蛋白( HbA1c) 。取出双侧肾脏， 称重 后， 计算肾重指数( 肾质量/体质量， KWI) ， 取 2 mm 厚的肾组织， 于 10%中性福尔马林固定， 石蜡包埋， 制成 4 m 的切片， 行过碘酸雪夫氏染色( PAS 染 色) 和 PTX3 免疫组织化学染色。用免疫组织化学 试剂盒 SP 法( 其中兔抗大鼠 PTX3 多抗购自 Abcam 公司) ， 实验步骤严格按说明书操作。每张标本在 高倍镜下( 400) 采用双盲法随机选取 5 个阳性视 野， 用 HPIAS1000 高清晰度彩色病理图文报告分 析系统进行定量分析， 测定 PTX3 的平均光密度值。 13统计学处理采用 SPSS 180 统计学软件， 计 量资料采用均数标准差( xs) 表示， 多组间均数比 较采用单因素方差分析， 两组间均数比较用 q 检验， 并进行相关分析， 以 P005 为差异有统计学意义。 2结果 建模过程中， DM 组中 2 只大鼠在饲养过程中 死亡( 死因不明) ， BE 组有 1 只在灌胃时突然死亡。 21各组大鼠血糖、 HbA1c、 KWI 及尿生化指标比 较DM 组及 BE 组血糖、 HbA1c 较 NC 组显著增加 ( P001) 。BE 与 DM 组血糖比较， 差异无统计学 意义( P005) 。DM、 BE 组大鼠的 KWI、 UAE 均 明显高于 NC 组( P001) ， 同期 BE 组较 DM 组显 著降低( P001) ， 较 NC 组显著增加( P001) ， 见 表 1。 表 1各组大鼠 BG、 HbA1c、 KWI 及 UAE 比较( xs) 分组n血糖/( mmoLL 1 )HbA1c/%KWI/( mgg 1 )UAE/( gmin 1 ) NC 组 11436101453021651036038008 DM 组 9284552319143451156148201032 BE 组 1024634181729268865049101016 注: 与 NC 组比较， : P001; 与 DM 组比较，: P001。 22肾组织 PTX3 免疫组织化学染色比较NC 组 肾小管上皮细胞胞浆、 肾小球内皮细胞胞浆中分别 只有少量的 PTX3 阳性表达或者不表达; DM 组表达 较 NC 组明显增高; BE 组表达低于 DM 组 ( P 0. 01) ， 高于 NC 组( P0. 01) ， 见表 2， 图 1。 23肾组织 PTX3 与尿蛋白排泄率相关分析在 固定变量血糖的情况下， 对糖尿病大鼠肾组织 PTX3 和尿微量白蛋白排泄率进行偏相关分析发现: PTX3 表 2各组大鼠 PTX3 平均密度值比较( xs) 分组nPTX3( 平均光密度值 IOD) NC 组 110042000021 DM 组 90291300327 BE 组 100163100156 注: 与 NC 组比较， : P001; 与 DM 组比较，: P001。 水平与尿微量白蛋白排泄率呈明显正相关， Pearson 相关系数 r=0931， P001。 41 湖北民族学院学报医学版第 3 期 注: A: NC 组; B: BE 组; C: DN 组。 图 1肾 PTX3 免疫组化染色( SP200) 3讨论 PTX3 属于五聚体蛋白超家族， 目前被视为典 型的炎症急性期反应蛋白， 是由于一些主要炎症信 号的刺激而产生的， 如 TL 受体激动剂， 白介素 1 ( IL1) 和肿瘤坏死因子( TNF) 。此外， 不同类 型的细胞一旦暴露于适当的刺激就会产生 PTX3。 长链 PTX3 主要由树突状细胞、 单核/巨噬细胞、 血 管内皮细胞、 成纤维细胞、 脂肪细胞、 神经胶质细胞、 卵丘细胞、 肾小球系膜、 细胞和滑膜细胞， 甚至淋巴 管内皮细胞等分泌和激活。在白细胞介素1( IL 1) 、 TNF、 白细胞介素6( IL6) 作用下分泌的组 织原型长链 Pentraxin 分子， 可能更直接反应血管的 炎症状态。Gustin C 等5 发现， 在动脉粥样硬化中， 血管内皮细胞受氧化修饰( ox) LDL( 特别是溶血磷 脂酸) 作用后， 通过溶血磷脂酸受体 1， 溶血磷脂酸 受体 3 介导， 通过 NFkB 途径， 促使内皮细胞合成 PTX3， 使单核细胞趋化、 聚集， 参与炎症过程。 微量蛋白尿是 DN 最早的临床检验异常指标， 同时也是内皮功能障碍与高循环炎症介质的强预测 因子。Naoto Katakami 等 6 检测了 78 例 1 型糖尿病 患者血浆 PTX3 水平， 尿微量白蛋白排泄率以及颈 动脉内膜厚度， 发现 PTX3 不仅与颈动脉最大内膜 厚度显著相关， 同时也是 DN 指标尿微量蛋白排泄 率的独立危险因素， 得出 PTX3 水平与动脉粥样硬 化的进展和 1 型糖尿病患者逐渐增加蛋白尿相关这 一结论。同样是糖尿病微血管病变， Hyun Seung Yang 等 7 研究发现 D 的进展与糖尿病的病程( P =0014) 以及 PTX3( P=0025) 的水平显著相关， 得 出血浆 PTX3 水平有可能与 D 的发生、 发展相关。 Suliman 等 8 报道 207 例慢性肾脏病 5 期需要透析 患者和 79 例土耳其 2 型糖尿病并蛋白尿， 肾功能正 常患者检测 PTX3 水平与蛋白尿以及内皮功能的关 系， 发现 2 型糖尿病患者 PTX3 水平较对照组显著 增加。在 2 型糖尿病并蛋白尿， 肾功能正常患者蛋 白尿与 PTX3 水平， CP 和 HbA1c， INS， HOMAI 呈正相关。并且， 糖尿病早期 CKD 患者中， PTX3 与 24h 尿蛋白排泄率独立相关， 从而得出 PTX3 与蛋 白尿是独立相关的。并且 2 型糖尿病患者中， PTX3 和蛋白尿均与内皮功能障碍相关这一结论。这与本 实验结果是一致的， NC 组只有少量的 PTX3 阳性表 达或者不表达， DM 组表达显著增加。 肾脏局部的肾素血管紧张素醛固酮系统 ( AAS) 是肾脏血流动力学的调节激素， 也是导致 肾病和心血管疾病的关键因素。病理情况下， AA 激活肾脏炎症与纤维化过程。临床和实验动物研究 发现， 血管紧张素转换酶抑制剂( ACEI) 有抗炎和抗 纤维化作用， 从而减轻 DN， 保护肾脏。孔敏等 9 报 道， 对 DN 大鼠应用贝那普利干预治疗后可减少糖 尿病大鼠尿蛋白排泄， 足细胞恢复减轻肾脏损害， 其 机制可能是上调了 nephrin NA 的表达， 从而维护 足细 胞 结 构 和 分 子 成 分，延 缓 DKD 的 进 展。 Yilmazd 等 10 发现， 在 2 型糖尿病并 1 期慢性肾脏 疾病患者， 雷米普利治疗 12 周后血清 PTX3， CP， 血清白蛋白和蛋白尿水平显著下降， 血流介导的舒 张功能显著增加， 说明短期 ACEI 治疗后， 血清 PTX3， CP， 血清白蛋白和蛋白尿水平显著下降。 减少蛋白尿的水平能减少促炎因子 PTX3 的分泌， 并改善内皮功能。本研究结果显示， 糖尿病大鼠肾 组织 PTX3 活性增加， 与尿微量白蛋白增加呈正相 关( r= 0931， P001) 。贝那普利干预后， PTX3 的 表达水平明显下降， 肾脏病变也明显减轻， 尿微量白 蛋白的表达也明显下降。说明贝那普利可通过减少 PTX3 表达， 降低了肾组织尿微量白蛋白的排泄， 从 而保护了肾脏。这与 Yilmazd 等 10 的实验结果是一 致的。虽然本研究提示抑制蛋白尿表达可减少 PTX3 的表达， 但其作用机制尚不明确， 需要进一步 研究。 参考文献 1 Katherine ， Tuttle BLinking Metabolism and Immunolo- gy: Diabetic Nephropathy and Inflammatory DiseaseJ J Am Soc Nephrol， 2005， 16( 6) : 1537 51 第 3 期湖北民族学院学报医学版 2 Lee GW， Goodman A， Lee TH， et alelationship of TSG 14 protein to the pentraxin family of major acute phase proteins J J Immunol， 1994， 153( 8) : 37003707 3 Marijn M Speeckaert， einhart Speeckaert， Juan J Carre- ro， et alBiology of Human Pentraxin 3( PTX3) in Acute and Chronic Kidney Disease J J Clin Immunol， 2013， 33 ( 5) : 881890， 893 4 uth Dubin， Yongmei Li， Joachim H Ix， et alAssociations of pentraxin3 with cardiovascuar events， incident heart failure， and mortality among persons with coronary heart disease: date from the heart and soul study J American Heart Journal， 2012， 163( 2) ， 273279 5 Gustin C， Delaive E， Dieu M， et alUpregulation of pen- traxin3 in human endothelial cells after lysophosphatidic acid exposureJ Arterioscler Thromb Vasc Biol， 2008， 28( 3) : 491497 6Naoto Katakami， Hideaki Kaneto， Fumie Sakamoto， et al Plasma pentraxin 3 levels are associated with carotid IMT in type 1 diabetic patientsJ Diabetes esearch and Clinical Practice， 2013， 99( 2) : 185191 7 Hyun Seung Yang， Jong Eun Woo， Sung Ju Lee， et alEle- vated Plasma Pentraxin 3 Levels Are Associated With De- velopment and Progression of Diabetic etinopathy in Ko- rean Patients With Type 2 Diabetes MellitusJ Invest Ophthalmol Vis Sci， 2014， 55( 9) : 59895997 8 Mohamed E Suliman， Mahmut I Yilmaz， Juan J Carrero， et alNovel Links between the Long Pentraxin 3， Endothelial Dysfunction， and Albuminuria in Early and Advanced Chronic Kidney DiseaseJ Clin J Am Soc Nephrol， 2008， 3( 4) : 976985 9 孔敏， 任伟， 王艳， 等盐酸贝那普利对糖尿病大鼠肾脏 足细胞及其蛋白 nephrin 表达的影响J 中国临床保 健杂志， 2012， 15( 1) : 4346 10Mahmut Ilker Yilmaz， Jonas Axelsson， Alper Sonmez， et alEffect of enin Angiotensin System Blockade on Pen- traxin 3 Levels in Type2 Diabetic Patients With pro- teinuria J Clin J Am Soc Nephrol， 2009， 4( 3) : 535 541 收稿日期: 20160710责任编辑: 艾 茜 ( 上接第 12 页) 3 Campo E， Merino MJ， Liotta L， et alDisrtribition of the 72 kd Type IVCollagenase Innonneoplastic and neoplastic thyroid tissueJ Human pathol， 1992， 23( 12) : 1 395 1401 4 高楠， 姜睿， 罗树立， 等CDK2AP1 与肿瘤J 中国实 验诊断学， 2010， 14( 1) : 156158 5 Leyre Bento， Gabriela odriguez Macias， Pascual Balsalo bre， et alole of Bcl2 Immunohis