课件：白血病细胞遗传学陈新科.ppt

白血病细胞遗传学 济宁医学院附属医院检验科 陈新科,一、白血病的细胞遗传学发展简史,虽然早在1914年德国学者Boveri就提出了染色体畸变是导致肿瘤的基本原因的假说，可是由于受到技术的限制，长时间以来人类染色体的正确数目一直无法搞清楚，自然更谈不上对肿瘤开展研究了。1956年Tjio和Levan通过人胚胎肺的成纤维细胞培养，终于确定人类染色体的正确数目为46.这一重要发现被公认为细胞遗传学发展史上的第一个里程碑。1958年Ford等在一例急性白血病患者的骨髓细胞中发现有44个染色体和1个断片的非整倍体异常，标志着白血病染色体研究的开始。1960年Nowell和 Hungerford在美国费城发现了2例慢性粒细胞白血病患者外周血标本中有小的异常染色体，这一发现迅速为许多其他学者所证实并将该异常染色体命名为Ph染色体，即费城染色体。这是人类肿瘤中第一个被发现的标记染色体，它激起了人们对肿瘤染色体研究的巨大热情，遂被公认为细胞遗传学发展史上的第二个里程碑。,白血病的染色体研究大致经历了以下4个发展阶段： 1、非显带时期（1958-1970年） 2、显带时期（1970年后） 3、FISH时期（1980年后） 4、多色FISH时期（1990年后),二、白血病的细胞遗传学研究的方法,（一）标本的来源和采集 按照肿瘤染色体研究的标本必须取自肿瘤组织本身的原则，白血病的染色体研究通常以采用骨髓为宜。当外周血白细胞总数10x109/L和原、幼细胞百分比10%时，也可采用外周血细胞进行短期培养。,（二）染色体的制备 1、标本采集。用肝素润湿的针筒抽取骨髓2ml或更多，立即注入含1640培养基的标本瓶中。 2、细胞接种。将标本瓶带回实验室后，先做骨髓有核细胞计数，再按照12x106/ml的细胞密度注入标本瓶中，将培养瓶放入37温箱中持续培养24或48h，其间定时摇匀培养物。 3、阻留中期分裂相。培养瓶中加入秋水仙素，终浓度为0.05ug/ml，摇匀后置37温箱中1h。 4、收获细胞。将培养物吸至尖底离心管，离心，1000转/min，10min。 5、低渗。弃上清液，沿管壁缓缓加入预温至37的0.075mol/L的KCl溶液68ml，吹打混匀后置37温箱中30min。,6、预固定。加入3：1甲醇、冰醋酸固定液1ml，吹打混匀。离心，1000转/min，10min。 7、固定。吸去上清液，加新鲜配制的3：1甲醇、冰醋酸固定液68ml，吹打混匀。静置至少30min后，离心，1000转/min，10min。重复固定三次，后两次静置时间至少15min。 8、制片。用吸管将细胞悬液轻轻打匀后吸取少量，从10cm高处滴至冰水浸泡过的玻片上，每片三滴，然后在酒精灯上来回通过数次，使其干燥。 9、显带。将玻片置于预温至87.5的 R显带液中孵育，时间以60120min为宜。 10、染色。标本用10%的Giemsa染色液染色1020min，流水冲洗，待干，镜检。,采集标本 短期培养 加秋水仙素1h 低渗30min 预固定 固定 制片 显带 染色,三、白血病染色体畸变的临床和生物学意义,（一）克隆性染色体异常的检出有助于白血病的诊断和鉴别诊断 特别是一些特异性染色体的重排不仅有助于AML和ALL的鉴别，而且有助于进一步识别它们中的亚型。1985年国际白血病形态学、免疫学和细胞遗传学分型讨论会将特异性染色体的重排和细胞形态学特征、免疫学表型等一起列为白血病诊断分型的重要指标，即以MIC分型代替既往单纯以细胞形态学为基础的FAB分型。新近世界卫生组织WHO提出的直接用特异性染色体易位或免疫表型来命名白血病的亚型，这进一步凸显出了细胞遗传学和免疫学在白血病诊断分型中的地位和作用。,当今WHO分型将AML分为四亚型： 伴有特殊染色体的AML 伴有病态造血的AML 治疗相关的AML和MDS 不伴特殊细胞遗传易位的AML,1伴有特殊细胞遗传易位的AML （1）伴有t(8;21)(q22;q22)AML, AML1（CBF）/ETO 的AML （2）伴有inv(16)(p13;q22)或 t(16;16)(p13;q22), CBF/MYH11的骨髓嗜酸粒细胞增多的AML （3）伴有t(15;17)(q22;q11-12),PML/RAR 及变异的急性早幼粒细胞白血病（APL） （4）伴有11q23(MLL)异常增生的AML,2伴有多系增生异常的急性髓细胞白血病 （1）有MDS或MDS/MPD病史 （2）发病前无MDS病史,3治疗相关的AML和MDS （1）与烷化剂相关 （2）与DNA拓扑异构酶抑制剂相关 （一些可以是淋巴系） （3）其他,4不伴特殊细胞遗传易位的AML （1）未分化AML （2）未成熟AML （3）成熟AML （4）急性粒-单核细胞白血病 （5）急性单核细胞白血病 （6）急性红白血病 （7）急性巨核细胞白血病 （8）急性嗜碱细胞白血病 （9）伴骨髓纤维化的急性全髓增生 （10）髓细胞肉瘤,（二）染色体畸变可作为监测急性白血病缓解、复发和CML急变的重要指标 急性白血病最初的核型异常经过治疗后完全消失而代之以正常核型提示CR。CR后原有异常重新出现，提示白血病复发。除原有异常外，又增添了新的异常，提示发生了克隆性核型演变，通常意味着疾病的进展如CML加速期或急变期往往在原有的t(9;22)的基础上出现+ph、+8、+19、 i（17q）、+21等异常。因此病程中反复多次染色体检查有助于判断急白的缓解、复发和CML急变。,（三）性染色体标志可用来验证异基因骨髓移植是否成功或确定白血病复发的来源 （四）染色体是独立的预后指标并有助于治疗方案的选择 诊断时的核型是急白最有价值的预后因素，它决定着患者获得CR的几率、CR持续时间和总生存期的长短。根据核型可将急白患者分为三个不同的预后亚型,与急白预后相关的细胞遗传学亚型 核型 预后等级 AML ALL 低危 t(8;21)、t(15;17)、inv(16) 50的超二倍体、t（12；21） 正常核型、+8、+21、+22、11q23 中危 del(9q)、del(7q)、del(12p)、-y 正常核型、6q-、t(10;14)、 t(11;14) 高危 -5、-7、del（5q）、3q重排、 t(9;22)、t(8;14)、t(4;11)、 复杂异常（3种异常） 亚二倍体/近单倍体,核型对治疗方案的选择也有一定的指导意义，最典型的例子为早幼粒细胞白血病患者若发现t（15；17）易位或PML-RAR融合基因，则提示将对全反式维甲酸或三氧化二砷治疗有良好的反应；反之，则疗效不佳。 t（12；21）易位或高二倍体ALL对左旋门冬酰胺酶和抗代谢药物为主的化疗方案反应良好。 t（1；19）则需要更强烈的方案方能获得较好疗效。 t（4；11）和t（9；22）几乎总是预后不良，需要高剂量化疗和在首次CR后进行异基因骨髓移植治疗。,（五）染色体发现为分子生物学研究提供了重要线索 染色体易位断裂点的克隆导致一系列与白血病有关的重要基因被相继发现，这不但对于白血病的诊断及其微小残留病的检测有很大的应用价值，而且对于研究白血病的发病机制和探索新的治疗手段也有重要的理论意义。,四、与FAB亚型相关的特异性染色体重排,（一）t（9；22）（q34;q11） Ph染色体约见于95%的CML患者，通常被认为是CML的重要诊断标志。根据Ph染色体的有无，可将CML与类白血病反应、骨髓增生综合征及MDS相鉴别。分子生物学的研究证明，原位于9q34的ABL原癌基因易位到22q11上和BCR基因的一部分融合，产生BCR/ABL融合基因，后者转录为8.5Kb的BCR/ABL融合mRNA，最终翻译成210KD的蛋白质。该蛋白质具有酪氨酸激酶的活性，它通过包括RAS在内的多种信号传导途径来活化癌基因和某些细胞因子，最终导致细胞的恶性转化。,CML患者经过新近问世的BCR/ABL信号传导抑制剂STI571治疗后，100%的患者可获得完全的血液学缓解，53%的病例有细胞遗传学的反应，其中13%为完全的细胞遗传学反应。 （针对易位靶点的研究将在白血病的治疗前景中发挥重要的作用。）,CML急变期，20%的患者保持46， t（9；22）核型不变，80%的患者可发生核型演变，即出现额外的染色体异常以致染色体众数增加至4750.最多见的额外染色体异常按出现的频率的高低依次为2Ph、+8、i（17q）、+19和+21。它们可单独或联合出现。染色体的丢失较少见，其中-7约见于3%的患者，多为急淋变。额外异常通常比临床和血液学急变征象早出现24个月，因此CML病程中定期进行染色体检测有助于早期诊断CML急变。,CML t(9;22),-Y,（二）t（8；21）（q22;q22） 该易位和AML-M2有特别的联系（92%为AML-M2 ，7%为AML-M4，个别为AML-M1）分子生物学研究揭示该易位导致原位于21q22的AML1基因易位到8q22上和位于该处的ETO基因并置，形成AML1-ETO融合基因。AML1系核心结合因子（CBF）的a亚单位。正常情况下，它和CBF亚单位结合，形成异二聚体的转录因子，从而调节许多与髓系细胞的生长和分化有关的基因的表达。 AML1-ETO融合基因通过对残存的正常的CBF a/转录因子的显性负调控作用，干扰了有关基因的表达，最终导致细胞的恶性转化。,（三）t（15；17）（q22;q21） 该易位只见于早幼粒细胞白血病，即AML-M3。约85%的AML-M3包括粗颗粒型和细颗粒型均可检出t（15；17），因而成为该型白血病高度特异的细胞遗传学标志。分子遗传学研究揭示原位于17q上的维甲酸受体a基因（RARa）易位到15q上和位于该处的早幼粒细胞白血病基因（PML）融合，形成PML- RARa融合基因。正常情况下，PML显示类似肿瘤抑制基因的活性， RARa则有促进分化和抑制生长的活性。 PML- RARa融合蛋白既破坏了核体的正常结构，又通过与PML或其他的维甲酸结合蛋白形成稳定的异源二聚体，从而对野生型的PML和RARa等位基因起显性的负调控作用，最终导致细胞的恶性转化。,临床上凡具有t（15；17）易位或PML- RARa融合基因的AML-M3病例应用全反式维甲酸治疗有效，反之则无反应，表明t（15；17）的有无对AML-M3的治疗有指导作用。 （1988年我国学者王振义在国际上首先成功应用全反式维甲酸（ATRA）治疗急性粒细胞性白血病（APL），不仅取得了很高的完全缓解(CR)率，而且不诱发DIC，不引起骨髓抑制，开辟了一条有别于联合化疗诱导治疗APL的新途径。由于费用低廉，使用方便等优点，ATRA是目前公认的诱导治疗APL的首选药物 ）,（四）inv（16）（p13q22） 该易位约见于8%的AML和25%的AML-M4患者。分子生物学研究揭示inv（16）导致原位于16p13上的平滑肌肌球蛋白重链基因（MYH11）和位于16q22上CBF基因断裂后并置在一起，形成CBF-MYH11融合基因。与AML1-ETO融合基因一样， CBF-MYH11由于阻断了CBF a/的转录激活功能而导致关键靶基因表达诱导的阻断。,（五）t/del（11）（q23） 该异常和单核细胞白血病有特别的联系，约见于22%的AML-M5。它可以是单独缺失，也可以是易位，后者常涉及11q23，而其“对手”染色体则不固定，约有54种之多。分子生物学研究揭示，所有这些融合蛋白都导致原位于11q23 的M