人波形蛋白重组质

人波形蛋白重组质粒表达对乳腺癌的增殖和侵袭的研究,作者 贾永喜 学位 硕士 指导老师 魏于全 教授,前言,细胞骨架(cytoskeleton),前言,中间丝(Intermediate filamenis，IFs),前言,Vimentin（Vim，波形蛋白）,前言,基于vimentin在癌细胞中表达是否为增强癌恶性程度的重要因素，明确波形蛋白对乳腺细胞表型的影响及其作用机制，本研究拟通过分子克隆技术构建的人vimentin基因真核表达质粒载体转染MCF-7乳腺癌细胞并筛选稳定表达细胞株，体外检测表达重组波形蛋白后对乳腺癌细胞增殖和侵袭能力的影响。,实验思路,双酶切验证vimentin真核表达质粒 pcDNA3.1-Vim。 pcDNA3.1-Vim 转染MCF-7 细胞 RT-PCR检测细胞内质粒表达 流式细胞术检测细胞内质粒表达 MTS细胞增殖试验 细胞体外侵袭实验,方法,验证vimentin真核表达质粒 pcDNA3.1-Vim。 将得到的pcDNA3.1-Vim 用BamH/EcoR双酶切，1琼脂糖凝胶电泳后鉴定重组子。,方法,按照以下配制20ul反应体系，置37孵育5h: 试剂 体系 pcDNA3.1-Vim 10ul 10xBuffer(yellow) 4ul BamH 1 ul EcoR 1 ul ddH2O 4ul,方法,pcDNA3.1-Vim 转染MCF-7 细胞 用10小牛血清的DMEM常规培养MCF-7细胞，按每孔105细胞数500l培养基细胞悬液接种24孔板，次日参照Lipofectamine 2000试剂说明书按pcDNA3.1-Vim和pcDNA3.1（+）各0.8l、脂质体2l分别转染HepG2细胞。,方法,G418筛选稳定表达细胞株 转染后48h，换800g/ml G418选择性培养基继续培养。未转染质粒的MCF-7细胞对照组于筛选10天全部死亡，转染pcDNA3.1-Vim和pcDNA3.1（+）的细胞筛选3周后，将G418浓度维持为400g/ml培养。建立的稳定转染细胞株MCF-7-pcDNA3.1(+)和MCF-7-pcDNA3.1-Vim分别命名为MCF-7-p和MCF-7-pV,方法,RT-PCR 分别收集约106细胞数MCF-7-pV和MCF-7-p及未转染的MCF-7细胞，依照Trizol试剂说明提取总RNA，用克隆Vimentin基因的引物，同时在相同反应体系中加入-Actin（1128bp）引物作为内参，按TakaRa试剂盒On Step RNA PCR Kit（AMV）一步法RT-PCR，检测三种细胞内Vimentin基因的表达情况,方法,流式细胞术 分别收集约105细胞数MCF-7-pV和MCF-7-p以及未转染的MCF-7细胞，4多聚甲醛固定，0.1皂素细胞膜打孔，用小鼠抗人单克隆一抗Vimentin 3B4和兔抗小鼠荧光标记二抗免疫荧光标记细胞，流式细胞术检测荧光强度,方法,MTS细胞增殖试验 分别收集用0.25胰蛋白酶消化生长状态良好的MCF-7、MCF-7-p和MCF-7-pV细胞，10小牛血清DMEM培养基重悬，严格控制稀释细胞密度均为5104/ml，每个孔加入细胞悬液100l，每种细胞6个复孔接种96孔板，三种细胞和一个阴性对照（仅加等量培养基无细胞的6个孔）共为4个组，置37、5CO2增湿孵箱培养。第二天开始观察细胞生长状况，至接种后72h，细胞融合度到达90左右，按照Promega公司CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay说明书直接在每孔中加入该试剂20l，置上述培养箱内孵育3h后酶标仪490nm波长读取吸光度并记录。,方法,细胞体外侵袭实验 按照BD Biosciences公司BD BioCoatTM Growth Factor Reduced MATRIGELTM Invasion Chamber说明书，取9个小室分三组置24孔板内，每个小室内加入500l 37无血清培养基，置细胞培养箱内水化2h。分别收集用0.25胰蛋白酶消化生长状态良好的MCF-7、MCF-7-p和MCF-7-pV细胞，无血清DMEM培养基重悬，严格控制稀释细胞密度均为5104/ml，每个小室内加入细胞悬液500l，每种细胞三个小室为一组，悬挂小室的9个孔内都加入750l以0.1牛血清白蛋白（BSA）作为化学趋化剂的DMEM培养基，置37、5CO2增湿孵箱培养24h。反复用细小棉签轻轻擦拭每个小室内底部并更换生理盐水冲洗后，95乙醇固定，HE染色，切薄膜置载玻片，显微镜观察计数细胞。,结果,pcDNA3.1-Vim质粒的鉴定,用BamH/EcoR双酶切重组质粒，取酶切产物和重组质粒5l，1琼脂糖凝胶电泳，结果显示酶切后得到与目的基因同样大小的1.4Kb片段（图1）。此重组质粒测序结果与GenBank的人vimentin cDNA ORF碱基序列完全吻合。,图1 限制性核酸内切酶消化鉴定重组质粒pcDNA3.1-Vim Figure 1 Identification of the recombinant plasmid PGEM-T-Vim by restriction endonucleases digestion M: DNA Marker; 1. pcDNA3.1-Vim digested by BamH/EcoR,MCF-7-pV细胞RNA水平表达vimentin,分别取MCF-7-pV和MCF-7-p以及未转染的MCF-7细胞RT-PCR产物5l，1琼脂糖凝胶电泳，结果显示MCF-7-pV高表达vimentin而两对照均为低表达（图2）。,图2 RT-PCR检测vimentin在MCF-7细胞中的表达 Figure 2 RT-PCR analysis of vimentin expression in MCF-7 cells. The level of -Actin（1.1Kb） expression served as control M: DNA Marker; 1: MCF-7-pV; 2: MCF-7-p; 3: MCF-7,流式细胞术,流式细胞术，重复3次，结果用表示，经t检验（0.05），荧光强度表明MCF-7-pV细胞明显高于MCF-7-p和未转染的MCF-7细胞，MCF-7-pV细胞表达了重组波形蛋白（表1）,流式细胞术,流式细胞术结果 MCF-7-pv 3.9 0.5 MCF-7-p 2.20.4 MCF 2.3 0.3 Negative Control 2.00.3 表1 流式细胞术检测稳定转染和未转染的MCF-7细胞vimentin抗体染色的荧光强度 Table 1 Flow cytometry determination of stably transfected and non-transfected MCF-7 cells using Anti-vimentin staining,细胞增殖能力,细胞的增殖潜能是通过MTS检测每孔相同细胞数5103的三种细胞培养72h后490nm波长的吸光率的大小来确定的。在完全相同的实验条件下每种细胞6个复孔，取平均值并计算其标准差，表示为：，经t检验（0.05），差别有统计学意义，MCF-7-pV细胞人工表达波形蛋白后降低了其增殖能力（表2）。,表2 MTS细胞增殖试验测定细胞490nm波长的吸光率 Table 2 The absorbance at 490nm measured using the CellTiter 96 AQueous One Solution Assay.,吸光率（490nm） MCF-7-pv 1.44 0.11 MCF-7-p 1.520.12 MCF 1.54 0.13 Negative Control 0.320.07,细胞侵袭能力,细胞侵袭能力 细胞的侵袭潜能用每个小室相同细胞数2.5104的三种细胞培养24h后穿过被覆类似人体上皮组织基底膜成分的基质胶滤膜（密布8m微孔）的细胞数来判定。每种细胞三个小室，在400倍光学显微镜下，每个小室滤膜计数两个视野，每种细胞有6个值，取平均细胞数并计算其标准差，表示为：，经t检验（0.05），差别有统计学意义，重组波形蛋白在MCF-7-pV细胞表达降低了其侵袭能力（表3）。,细胞侵袭能力,细胞 侵袭细胞数 MCF-7-pv 174 MCF-7-p 446 MCF 407 表3 体外侵袭试验统计每个高倍（400）视野下平均的侵袭细胞数 Table 3 The invasion assay was counted mean number of invasive cells per field under 400 magnification.,讨论,人VIM基因位于染色体10P13，其cDNA全长1847bp，开放性阅读框1401bp，编码466个氨基酸的波形蛋白。该基因在不同高等脊椎动物中高度保守，与小鼠该基因DNA序列同源性为91.7%，与猿猴、小鼠和犬的编码氨基酸数目完全相同，同源性依次为99.6%、97.4%、和98.1%。,讨论,关于Vimentin过去的研究认为主要与维持细胞及细胞器形态、参与有丝分裂和细胞分化、促进细胞粘附和移行、创伤愈合、信号传导、移植免疫和细胞凋亡等有关。但基因敲除证实缺乏vimentin的小鼠对其生长发育、生殖及组织细胞结构和功能都无明显影响。体外培养细胞都不同程度表达波形蛋白，与细胞的永生化密切相关,讨论,Gilles等将波形蛋白在上皮性肿瘤细胞的表达，以及促进肿瘤细胞侵袭转移的现象定义为EMT(上皮性细胞向间质性细胞转化)。在EMT过程中，上皮细胞具有了成纤维细胞的特性：黏附能力减弱、运动能力增强，于是肿瘤细胞极易发生侵袭转移。,讨论,在此之前，Singh等用相近的实验条件在前列腺癌细胞株LNCaP中稳定转染表达波形蛋白和，Hendrix等用小鼠vimentin基因克隆载体稳定转染MCF-7的研究增强了癌细胞的移动和侵袭力。Andreoli等用人vimentin重组载体转染鼠胚胎性癌细胞株F9减慢了细胞的增殖,讨论,肿瘤细胞生物学表型的改变和肿瘤发生一样，都是多基因控制调节的复杂网络系统，单一基因表达的变化会引起多个基因表达状况随之发生改变。除了肿瘤细胞内在的基因调控外，生长环境及宿主也会对其生物学表型产生重要影响。在不同的实验条件下以及运用同源或异源基因克隆都会对癌细胞表型产生不同的影响。,讨论,我们的研究让乳腺细胞过表达波形蛋白，不但没有增强其增殖和侵袭，反而部分逆转了其恶性表型，表明该蛋白不是促进癌细胞的恶性表型的直接原因，应该是癌细胞恶性程度增强后才引起的表达增加。,讨论,综上所述，通过转染波形蛋白基因增强乳腺细胞癌表达波形蛋白，影响到癌细胞形态和生物学特性，扰乱了癌细胞自身的稳态，重组波形蛋白反馈调控某些肿瘤生长相关基因的表达水平。增强了表达波形蛋白的乳腺癌细胞表现为凋亡增加、增殖和侵袭能力降低。本研究提示重组波形蛋白在癌细胞中表达可以部分逆转其恶性表型，有望成为恶性肿瘤基因治疗的新靶点,结论,1.构建的重组人波形蛋白基因VIM质粒载体pcDNA3.1-Vim正确。 2建立了稳定高表达波形蛋白的乳腺细胞癌细胞株MCF-7-pv。 3. MCF-7-pv细胞的体外增殖、侵袭力降低。 4重组波形蛋白参与了乳腺癌细胞生长、侵袭的调控，部分逆转了肝癌细胞恶性表型，其机理可能是波形蛋白调控某些肿瘤相关基因的表达有关。,致谢,在生物治疗国家重点实验室攻读硕士生涯即将结束，此时此刻，带着留念，内心充满无限感激。 导师魏于全院士在课题的设计、实验的实施、论文的撰写等方面给予我悉心指导和帮助，定期询问了解研究进程，为我指点迷津，帮助我开拓研究思路。他严肃的科学态