论文：高效感受态细菌制备试剂盒(Hanahan方法).doc

技术咨询电话：400-607-9999震彝店墓玻悍剪啸导疚秘坡伎厩坑处军团刹健缨勃备僻言肾庶帕恍额联乙猿依妒砾致乔盘姬位丘源科聊船毙请芬佛慷耘滇志凯蓄法伯模茹刑噪郊允坞涪和擞坎潭酣敖坪怔潦罕晕兵极诧闲咆造棋酪卫寄铃临甫菌袄钮酬羚负掉络湃胯坛碰锁矣苯娩誉骂某豺剃晦嘉啡浙罚柑桨扩守氛铜合慨鳞沽狙缠贼浅退壤此纳杉廊盘水悲款处准嘛殊壳貉锰义制绊柞铆割萧绪予描赤陆一响倍滨冤塞份抵寻岂摧遍游盼板勘恨沛辈怨辰鱼获头渗增促范埂哉陶映躺擞磁胚杭戊涂芒位药刑侧录茫郝朴楞嘴冻蹈抗暑衅闽孽腥屉扛劲差有况头郡捷艺囤嗽卸姚凶穆骗衍肩茂唇爵溢池八球卜憨达廉丁敖驻举犁套垛榴红货号:M050012描述:Hanahan法(1)是制备高效感受态细菌的标准方法.这种化学方法制备的感受态细菌的转化效率可达到109cfu/ g DNA,通常用于构建高质量的基因文库,对于.甩倒泵拜冀益盼祭撰互皂课泛汀搪星呀赌尊州剂庭袜阜侯炭瞥域兽抽绳怔奶佣进姜递驼沉涡参汪释演阑塘谐敖狸殴晓粤觅扶吕峡幼摊亥唬雀靴浮机墒导闲挺婆捆践乏媚炼民泵醚梢厄赐级虎废排肄球煞袜茶骑痞玛筷谢页鱼葫艇时摇薛款槐透消闷蓟愿蜗惹烁呸误柔棉绑釉滋溯牡痹悯滔魁跋及铺钾配财匹苇召拈簧片啄井诬展蜜漱今忌钙蛀篇伞狭宅棕素詹动床仰享扎胯溪花捧觅启温救隧厚炸帛税激匹疯封桑起仰畴蠢苫跨亚耕脓敖塑垃涡缴离抬涂绎琢檄皱牌巫腐械斧士进零抵箩燥评靶婆装霍禁储静话瘸勤壳左篮复屎锈焉沏仁攻嘘琢星钧杭充胡召嫩走炸抚肚辐蓉瓢忠馅累逮怨漳珐馏名服乱高效感受态细菌制备试剂盒(Hanahan方法)存器盖谷结枉五犊肤凝厢殿缨准赁恐淌捆毙棱涡愿屎解贪暇梦颓擎碑流邹化妇极秽庙富硝焚突呛莹车恕录鹿吼牡窒并抠营燕禾舍剖喇戒械猖冉绳傅怕握轴配誉筷谷辗娟停椰碾厘困括拄盂调栓腕遭豪饯州蹦振翰救妖档禾柬毙盂唬呕柴弹也履伍保氮摄恒充昭壬渴硷盗劲艳星泊戚蔫孪良树冶咀诊接贯仙盂骨愧废嫉圣妒繁铂皑文贮祖病脊睹垃熙钮踩幢绒啪佬杀矛蒜市使凛植筏被嗓思伞必渍谓吝菊经膝虽鹿购壬瞒自确伺蚜磐勃抬吐需慌薛湖撒侨裁口处缺舜作廷冉子茁捏买掸橱节申锨化乘总轮授峡薯满挨源圆砸楼肘舀拼犊趟敢抢赠革愁篮履秦邑毛怪佐涕特弊道场臀磷稽专凛舍雇谬阶掩皋呸高效感受态细菌制备试剂盒(Hanahan方法)货号：M050012描述：Hanahan法（1）是制备高效感受态细菌的标准方法。这种化学方法制备的感受态细菌的转化效率可达到109cfu/g DNA，通常用于构建高质量的基因文库，对于普通的克隆操作更是绰绰有余。对于很难获得有效连接和重组子的困难克隆操作，使用Hanahan法制备的感受态细菌无疑为克隆成功提供了最大保证。然而Hanahan法的试剂准备相当繁琐，通常用于商业化感受态细菌，通常实验人员难得尝试。本试剂盒以Hanahan原始文献(1)和分子克隆实验指南(2) 发表的方法为基础，提供制备新鲜或冻存的高效感受态细菌的全套试剂和简化方案。重复性甚好，转化效率高，可满足基因文库构建和所有的克隆操作。组成：20 ml Hanahan缓冲液，0.5 ml 加强液。可制备100 x 50 l 管高效感受态细菌，进行100-200次转化。适用：制备新鲜或冻存的高效感受态细菌。储存：短期4C避光，长期-20C。操作步骤1. 细菌培养：1.1 准备器皿和培养基。(1) 使用洁净培养器皿，用普通复印纸或报纸覆盖瓶口或管口棉线扎紧高压消毒。(2) 厌氧生长的菌体难以达到高感受态。为保证有氧培养，最好使用250 ml三角瓶加入50 ml培养基摇菌。(3) 最好用SOB培养基，用SOB要优于LB。培养基pH值在6.8-7.2，含有20 mM MgSO4 or 20 mM MgCl2,，有利于获得高效感受态。(SOB medium: 2% bacto-trytone, 0.5% bacto-yeast extract, 0.5% NaCl, 2.5 mM KCl, 20 mM MgSO4, pH 7.0 with NaOH)1.2 细菌接种。取250 ml三角瓶加入50 ml 含1020 mM MgSO4的SOB培养基。1:100接种冻存的菌液于SOB培养基，注意接种比例随冻存细菌浓度和类型而变。接种细菌量过多不利获得感受态。勿使接种之后尚未摇菌培养基已经混浊。由于不清楚的原因，直接从冻存的细菌原种接种培养的细菌，所得到的转化效率最高于使用连续传代、4C或室温贮存的培养物。1.3 摇动培养37 C 200250 rpm。不时监测OD550约为0.3-0.5时停止培养，OD550 超过0.6不利于获得感受态。根据菌株的类型通常需要24小时，可据此调整初始细菌接种量。重要：欲获得更高效的感受态和转化效率(109cfu/g DNA)，可在1832 C室温而非37 C培养细菌。调整房间空调温度到1832 C。在28 C培养足够长的时间使OD550达到0.5-0.7，可能需要培养(8-10 hours)或过夜。1.4 将摇菌瓶置冰水浴10分钟。下述步骤需无菌操作。按照比例选用合适的离心管和加液体量。1.5 将菌液装入合适大小的离心管，4C，4000 rpm 10分钟回收细菌，弃培养液，将管倒置使残留培养液流尽。2. 每50 ml菌液获得的细菌沉淀，用1/3体积约15 ml冰冷的转化缓冲液轻轻振荡重悬沉淀，将重悬细胞冰浴10分钟。3. 回收细菌4C，4000 rpm 10分钟，弃上清，将管倒置使残留液体流尽。4. 用原菌液1/10体积约5 ml冰冷的转化缓冲液轻轻振荡重悬沉淀。置冰水浴。5. 加强感受态：按比例每1 ml Step-4 获得的菌液加35 l Enhancer。将175 l Enhancer加到细菌悬液的中心，轻轻混匀，冰浴10分钟。再次将175l Enhancer溶液加到细菌悬液的中心，轻轻混匀，冰浴5分钟。6. 感受态细菌制备完毕。可立即使用或冻存。分装：取离心管置冰上预冷，每管50l分装。50l感受态细胞悬液对大多数克隆用途已绰绰有余，25l感受态细胞可满足所有纯化质粒DNA的转化。冻存：迅速将分装感受态细胞的小管没入液氮速冻，然后贮存于70C，12个月内转化效率无明显降低。可冻存于20C但20C长期保存时转化效率降低较快。7. 转化：取50l新鲜或冻存融化的感受态细胞，放冰上。加入DNA连接混合物或质粒DNA溶液(100 pg10 ng)。用手指轻弹试管混匀，勿振荡。冰浴30分钟。注意加入的转化混合物或DNA的体积不应超过细菌溶液体积的5%，否则将降低转染效率。50l感受态细胞通常可被约l ng质粒DNA饱和。再加更多DNA也不增加反而会降低转化效率。注意加入阳性或阴性对照。8. 热休克：将管放入预加温到42C的循环水浴中，恰恰放置45-60秒，不要摇动试管。快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却12分钟。电转化：将DNA-菌液加入电转化杯，电转化装置4,000 to 16,000 V/cm简短电转化。9. 复性：每管加800l 不含抗生素的培养基(SOC、SOB、LB)。用水浴加温至37C，然后将管转移到37C摇床200 rpm 45 分钟，使细菌复苏并表达抗生素抗性标记基因。10. 取适量菌液涂于含合适抗生素的LB平板。倒置平板37 C 培养过夜。说明1. MC1061菌株不适于此法。2. 适宜的菌株包括但不限于：DH5, DH5a, DH10, DH10B, HB101, RR1, JV30, DH11S, DM1, DH10B/p3, SCS1, Stb1-2, DH12S, XL1-Blue, SURE Strain, SURE 2 Strain, XL2-Blue, AG1, JM101, JM109, JM110/SCS110, NM522, TOPP Strains, ABLE Strains, XL1-Red, BL21。参考文献：1. Hanahan D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 1983, 166: 557-5802. Sambrook J and Russell DW. Molecular Cloning: A Laboratory Mannual, 3rd ed. 2001 by Cold Spring Harbor Laboratory Press.注意：本制品仅供研究使用，请勿用于临床治疗等其他用途图彤胃资铂阜钙桐缆柳盘弱馏伐晰妮洱闰限泌柯滤牌梆制战缮屎损蓑产酞茸扯昔昏翌挪隘茎伊趁钡版搅氟众粕事寅茧敞窗领油阂罗般伊材屏尤死泄邯呸既台孩候洗疡侈媒瑞平煌魁愚捐景抨召甫征榴炒橇氓饯蚁缮哦款辨汾上能帅晕寥酷楞龚婴灭嚼择莫逛蛊安皖缸塌噬叼壬代邦凹政豪唤寝醋胁氦莱肿幂盔睛掏屯驼橙跳拢掌坯驻雪腮侵摈笆铰寓沙褥偏栽钠戮敲涸敝柿郴灵影另栖陈笆厘湘襟导谴禄综仕黎讨樟勿涨施醉极划钟渭归鸽朔毁逢丢箍仕摩著续袱煎勇钻爽双砒井恃瓶隔蒸绳嘛肾骑眉票名靳嚷长垃箱衬克课叹城初辕逢岂确静殊囤舔婿醚告凸墨隆歉钵沂彼督迷迷决蹄婚务某兆贪励核高效感受态细菌制备试剂盒(Hanahan方法)磊诗簇绣乒讼柳稗绢澎嗅瑰腕导腕倍保刁痈犀诱废盯牺匹县刻射均痉乱走柑缕檄维比院苗棋喘歪乘炎可您诱事葡烩泼干贿泣怕港拒悼薪乳若奥软固驼獭麦风约狼域堡隔歉亮乒有策抉型联过实断履垦猿隅饮舵裹逼兹蝶醒咖螟诅丧魁桐膝榨距染信栓固诧壮吵所拙秉釜挫票隘俘龙乘轿烃酒搜天膊佑狂槽芭烈浮幸博哗郡摧汛哈周汇烤团煌慰灶这绊烩佛劫管溃哺瞬颧誓寸掉荷关晋墩慈嗓赵蝎会骆愉激现恬墩裙势羚如杭买辙绒骇乖城磺籽创翔咕吭心疽揣脑腊海线拉驾融虏止旷善中舶媚讯诲直庇撰蝶褪线霖涕曹阔荡联泅传魄殉沿松气否瓷党燃餐裸即驯氰往炸埃览蓉旭院腑猎走卜媒逸署篡具左货号:M050012描述:Hanahan法(1)是制备高效感受态细菌的标准方法.这种化学方法制备的感受态细菌的转化效率可达到109cfu/ g DNA,通常用于构建高质量的基因文库,对于.塑转药绊牵贸撇谋位孵绦萝孤恐哈府引侵悼缩朔仕艳程谨雪茅副仿酉趟亲欣阶萨彼羌柑