分子生物学实验报告(模板).doc

从基因组中获得甘薯ADK基因 生物工程类分子生物学实 验 报 告200X级生物XX专业 XX班 实验X组组长: XX 22200731724XX组员: XX 222007317242XX XX 222007317242XX XX 222007317242XX XX 222007317242XXXXX年X月从基因组中获得甘薯ADK基因XX,XX,XX,XX,XX(西南大学,生命科学学院,重庆 400715)摘要：从甘薯的新品种渝苏303中提取基因组DNA。先以此DNA片段为模板使用PCR技术在体外扩增扩增获得 adk 基因核心片段，再扩增目的基因片段通过琼脂糖凝胶电泳并回收，在16与T载体连接30min以上用于转化DH5感受态。-。关键词：甘薯；PCR技术；基因克隆；转化To Obtained the ADK gene from the genome of sweet potatoXiong Chun-Qing, Zhang Li, Huang Jia, Jiang Yue, Li Wen(College of Life Sciences,Southwest University,Chongqing 400715)Abstract: The new varieties of sweet potato, 303 Yusu extracted genomic DNA. Adenylate kinase gene of potato extract (ADK) and antisense expression vector construct. To make use of this DNA fragment amplified by PCR, in vitro, and then the initial or the target gene fragment was amplified by low-melting-point agarose recovery in more than 16 for 30min to connect feelings into DH5 state. State will be felt into DH5 E. coli DH5 competence, plasmid DNA in a large number of receptor cells and then choose to copy the positive transformation of body, to carry out gene extraction. Bioinformatics analysis showed that the highest level of starch synthesis in the plants, adenylate kinase and the molecular evolution of the highest genetic similarity. Access to the engineering bacteria strain can be used for genetic transformation of potato, sweet potato and cassava starch and other important crops, for the realization of starch laid the foundation for metabolic engineering.Key words: sweet potato; PCR technologies; gene cloning; transformation1 综述：甘薯 学名：Ipomoea batatas Lam. 英文名：Sweet Morningglory旋花科(Convolvulaceae) 属一年生或多年生蔓生草本，又名山芋、红芋、番薯、红薯、白薯、地瓜、红苕等，因地区不同而有不同的名称。块根可作粮食、饲料和工业原料。是我国的主要栽培作物, 常年种植面积6106 hm2左右, 栽培面积和总产量均居世界首位,它所富含的淀粉是重要的轻化工和食品加工原料。“渝苏303”是西南师范大学在育成“ 渝苏1号” 、“ 渝薯34”、“ 渝薯20” 之后,于1991年从江苏省农科院提供的B58-5 X苏薯1号组合的杂交种籽中选育而成，原系91-31-303。 “渝苏303”具有较好的丰产性和适应性, 在试验中其藤叶、薯干、生物鲜产、生物干产、淀粉产量和在生产试验、台位试验中的鲜薯产量均增产,尤以淀粉、藤叶产量增产幅度最大并且, 该品种具有萌芽性较好, 结薯习性好, 大中薯率高, 薯块烘干率和出粉率高, 抗黑斑病和根腐病, 高抗茎线虫病, 贮藏性好的区试结果。ADK即腺苷酸激酶(EC.2.7.4.3，adenylate kinaSe，ADK)，它是平衡腺苷酸代谢库的关键酶, 能够催化AMP+ATP 形成2 分子ADP 的可逆反应, 是调控这三种前体分子在淀粉代谢库和核酸代谢库中分配的关键酶，其表达量直接影响腺苷酸在糖类代谢库和核酸代谢库中的分配。生物信息学分析表明, 在淀粉合成水平最高的植物中, 腺苷酸激酶的分子进化水平和遗传相似性也最高，因此, 作为腺苷酸代谢库调节中枢的ADK 基因( adk) 是淀粉代谢工程的重要候选基因, 将该基因表达量控制在较低水平就可打破腺苷酸代谢库的平衡, 使腺苷酸代谢流向淀粉合成的方向流动。用基因工程技术获得的含有ADK基因工程菌菌株可用于遗传转化马铃薯、甘薯和木薯等重要的淀粉作物, 为实现淀粉代谢工程奠定了基础。本次试验就是利用从甘薯“渝苏303”中提取ADK目的基因，通过连接制备重组DNA，然后导入到大肠杆菌细胞中，通过筛选检测目的基因是否转化成功。本次实验涉及DNA的提取，PCR扩增目的基因及检测，目的基因回收与连接，大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备，连接产物的转化筛选和PCR检测，以及选做实验质粒DNA的抽提与酶切，原理上根据目的基因的制备，重组DNA分子的构建，重组DNA分子转移到受体细胞，转化子的筛选，和目的基因表达与功能的鉴定的操作步骤，从分子层面直观的告诉我们了基因工程技术中的操作方法和实现手段。技术路线：2 材料方法2.1材料2.1.1 植物材料渝苏303为西南大学重庆市甘薯中心利用甘薯近缘野生种Ipomoea trifida与甘薯进行的种间杂交选育而成的淀粉用甘薯品种，通过国家及四川、重庆、江西、江苏品种审定委员会审定、并在生产中得到了大面积推广。 华北52-45 南瑞苕 徐薯18 新大紫 胜利百号B58-5 Y10(I.trifida.2n=6x=90)H11-67 南瑞苕渝苏303 华北52-45 胜利百号 南瑞苕苏薯1号 华北52-45 图1.渝苏303系谱图 Fig I Genealogy of Yusu 3032.1.2 试剂药品及仪器试剂药品CTAB抽提液：2%（w/v）CTAB，100 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，20 mmol/L EDTA(pH8.0)，1.4 mol/L NaCl醋酸钠：3 mol/L NaAc（用冰乙酸调pH值至4.8-5.2）TE溶液：100mmol/L Tris-HCl，1.00 mmol/L EDTA（调pH值至8.0 ）液氮100L,Taq DNA聚合酶，10PCR buffer，25mmol/lMgcl2，0.225mmol/ldNTP， 10umol/l引物，模板DNA分子（0.1-2ug/ul），LB培养基、卡那霉素储存液，marker(DL2000)1支，Amp，Cm，T-Easy Vector，LB培养基液体20mL10，蛋白胨1瓶，酵母提取物1瓶，NaCl 1瓶，甘油，100mL，CaCl2 1瓶，ddH2O，限制性内切酶等仪器设备PCR扩增仪，PCR用薄壁管，移液枪及电泳仪等，DNA回收试剂盒，恒温水浴锅，超净工作台2台， THZ-C水平摇床2台，冷冻离心机1台，锥形瓶310个，室内使用的大中型枪头各2盒，两面板（蓝板）1个10，浮标，1个10，室内使用的1.5mL的EP管110盒，凝胶成像系统1台，大中小型枪头各3盒，涂棒10根，恒温培养箱1台，THZ-C水平摇床2台，封口膜1盒，LB+Amp平板1个10，LB+Cm平板1个10，LB+ Amp + Cm平板1个10，一次性PE手套，常规PCR试剂1套10，引物1对10，计时器1个10，质粒小量提取试剂盒2个，电泳仪1台，水浴锅2台，凝胶成像系统1台，DNA/Hind1支，离心机110台。工程菌：大肠杆菌DH5a菌株2.2.实验方法2.2.1 DNA 的提取按照分子生物学实验指南（生物工程与生物技术教研室）操作。2.2.2 PCR扩增目的基因与检测按照分子生物学实验指南（生物工程与生物技术教研室）实验二操作。2.2.3 核酸片段的回收和连接按照DNA凝胶回收与纯化试剂盒（柱离心型）上所述方法对已检测并可使用的DNA进行回收、纯化及检测。2.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备按照分子生物学实验指南（生物工程与生物技术教研室）实验四中的CaCl2法，感染预先准备的大肠杆菌DN5菌株。2.2.5 连接产物的转化、筛选及PCR检测按照分子生物学实验指南（生物工程与生物技术教研室）实验五中的方法步骤，进行连接后DNA的转化、筛选及PCR检测。3.结果与分析3.1提取DNA时电泳检测： 1 1 2 2 3 4 5 6 结果说明：第六条为我们小组的实验成果。图中显示我们小组的条带最明显，亮度高，提取成功，可以进行下一步的试验操作。结果与分析：1）我们组的条带明显，DNA条带呈涂抹片状，说明在抽提的过程中有一定程度的降解。2）条带和其他小组的条带差不多亮度，说明此次提取的DNA的浓度高且杂质少。3）研磨时不要用力过猛，使细胞破碎充分，所以得到的DNA较多。4）DNA提取产物用于下步PCR反应。3.2 PCR电泳： 1 2 3 4 5 6 maker 1 2 3 4 5 6结果说明：四组为我组的实验成果，图中显示我们小组的条带亮度较高，目的基因扩增成功。结果分析：1）我组条带有2段，且亮度很高，条带清晰，分界明显。说明反应充分，扩增产物多。2）从电泳检测图中可以推断，最上端为DNA条带，最下端跑胶最远的是未降解的引物RNA的条带。3）但是每组一共做了两条，有一条（4）没有跑成功，说明扩增产物浓度低，可能由于操作中产物部分降解。4）此外，从本次的操作中，Taq必须最后加入体系，这是因为酶极易失活，应该在低温下操作。引物浓度不宜过高，过高容易形成引物二聚体。5）琼脂糖凝胶电泳检测的结果保留用于下步核酸片段的回收。3.3 胶回收电泳：2000bp： 1 2 4 5 6 maker 1 2 35 64、860bp： maker 1 3 5 6结果说明：前面为2000bp片段的核酸片段的胶回收，第四组是我们组的实验成果。图中显示我们小组的条带很明显，成功地回收了目的基因。后面的为860bp的核酸片段的胶回收，第四组是我们组的实验成果。该图显示我们组的条带没有跑出，说明没有回收目的基因。结果分析：1）在2000bp的核酸片段的回收中，我们组（4）的条带很明显，存在目的基因的条带区，说明我们成功地回收了目的基因。成功回收到条带，有利于我们后续实验的进行，回收产物保留后进行下步连接反应。2）在860bp的核酸片段的回收中，我们组（4）的条带暗淡，不存在目的基因的条带区，说明我们组没有回收到目的基因。3.4 菌检PCR电泳图 maker 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14结果说明：图中显示了各组菌检PCR电泳的实验成果。可以看出，每组的条带都没有分离，说明都没有成功。结果分析：1）第四条为我们组的PCR跑带，颜色比较亮、清晰，可是，没有连接成果，所以都聚集在一条上。2）可以看到其他各组的此次操作都没有成功，都聚集在一条带上了。说明片段都没有成功连接上。3.5 平板： 2 1 结果分析：编号为1是我们第一次的做的转化的平板，在培养以后并未长出大肠杆菌的菌落，说明转化并不成功。转化未成功说明很有可能是因为DH5感受态细胞制备不好；编号为2的是我们组第二次做的大肠杆菌平板，在平板上可以很明显的看到均匀分布且数量极多的菌落，说明此次转化做得很好；在本次操作中，我们正确地做对了各个步骤，并且都很完美的完成了，所以得到的最终结果是成功的。-4 【实验总结】此次试验，我们的实验内容是DNA的提取及检测、PCR扩增目的基因与检测、目的基因的回收与连接、大肠杆菌感受态细胞的制备、连接产物的转化和筛选及PCR的检测等实验。本次试验持续的时间较长，操作步骤较多，本组的组员也较积极，但配合度仍有不足。虽然本组的实验得到了较好的结果，但在整个操作过程中仍暴露了一些操作上的问题，例如移液枪的使用：在加入试剂时手会不稳，易抖动，这往往会造成加入试剂的量有问题或造成污染，影响实验结果。但在曾老师的细心教导及大家的不懈努力下，每位组员在实验技能方面均有不同层次的提高。虽然在整个的试验过程中，大家遇到了产物转化失败的问题，但我们都没有泄气，我们认真的分析实验失败原因，并积极地克服困难，最终的实验结果是让人满