痘病毒载体的应用.doc

痘病毒载体的应用翟新验*卢胜明（北京实验动物研究中心北京100012）摘要简单介绍痘病毒载体的实际应用。其原理是通过同源重组将外源DNA插入到痘病毒基因组的非实质区域，表达的外源蛋白能正确地进行修饰，并有较高的表达效率，可刺激机体产生免疫应答。痘病毒载体作为基因工程中的重要工具，其应用极其广泛，已成功地表达了来源于植物、动物，乃至人类的许多基因。关键词痘病毒载体应用收稿日期：20050405修回日期：20050913* 电子信箱：痘病毒科是一大群、专性的病毒，直径300400nm，脂质蛋白外壳，包绕着一个复杂的核心结构此结构含有一个线性近20kb双链DNA分子，编码多个亚单位，DNA依赖的RNA聚合酶，转录因子，帽结构和甲基化酶，多聚A聚合酶，都在病毒核心中包装，并转译成mRNAs。痘病毒在感染细胞的胞浆内增殖，这在DNA病毒是独有的。痘病毒中研究最多的是痘苗病毒。许多病毒的DNA分子具有感染性，将裸露的基因转染进细胞后能够进行复制，而痘病毒借助细胞酶并不能转录病毒基因组，因此，并不能产生病毒蛋白。其DNA则不具有传染性1,2。痘病毒含有能够被真核细胞识别的启动子，这些启动子不但可以引发动物基因工程中常用的一些标记基因的表达，而且还能够引发克隆的外源基因的表达。痘病毒经过改建后，可以发展成为表达外源基因的分子载体。痘病毒早期基因的表达产物中，胸苷激酶是一种易于鉴定的标记，胸苷激酶编码基因是位于痘病毒基因组DNA的ind IIIJ片段上。痘病毒正常功能的表达并不需要这个片段，当其被外源DNA取代之后，不会影响病毒基因组的复制。将编码胸苷激酶基因的痘病毒基因组的ind IIIJ片段，克隆进质粒载体分子上，并在此非必需区中插入痘病毒启动子，在启动子下游连接欲表达的外源基因。接着对感染痘病毒12h的细胞，转染上述质粒，使重组质粒中所含的痘病毒非必需区序列，与痘病毒非必需区序列发生同源重组，外源基因在这一过程中重组到痘病毒基因组中，形成重组痘病毒粒子3。1982年，研究人员将外源基因插入痘苗病毒的TK基因中，首次成功地构建了在哺乳动物细胞中表达外源基因的重组痘苗病毒1。近20多年来，应用重组痘病毒成功地表达了来源于植物，动物，乃至人类的许多种基因。被表达的外源蛋白，在感染细胞中，能忠实地进行修饰，与其它哺乳动物病毒表达载体相比，具有较高的表达效率；通过对动物接种重组痘病毒的方法，能了解外源蛋白对个体的作用以及机体的免疫应答；表达抗原基因的重组痘病毒，可作为基因重组疫苗。痘病毒作为基因重组活疫苗的载体，不需佐剂即可免疫动物，病毒在体内增殖过程中产生的外源蛋白可刺激机体产生免疫应答，不仅诱导机体产生体液免疫，而且诱导很强的细胞免疫1。1痘苗病毒重组体和NYVAC痘苗病毒是原型痘病毒，感染多种细胞和实验动物，它是第一个痘病毒科中用于表达研究的病毒。痘苗病毒狂犬病毒糖蛋白G重组体，是早期成功利用痘苗病毒载体的例证4 。痘苗病毒作为表达载体具有下列几个特征：大分子基因组；重组病毒构建相对简单；细胞型的选择广泛；细胞浆内表达，减少了对核加工以及核RNA运输的特殊需要；依靠痘病毒基因组启动子，能有效地表达外源基因，并有很高的表达水平3。利用痘苗病毒Copenhagen株构建的表达载体，将编码狂犬病毒糖蛋白的cDNA插入在此载体胸苷激酶座位中，破坏胸苷激酶座位，利用生物化学方法选择重组体。将此重组体作为活疫苗免疫动物，已获得了很好的效果5。另外有报道，痘苗病毒重组体指导氯霉素乙酰转移酶基因的表达6。NYVAC是痘苗病毒Copenhagen株致弱基础上发展的载体，从痘病毒基因组中精确地删除了与病毒毒力相关的基因，以及其它的与宿主复制竞争的、无用基因。NYVAC载体高度致弱的同时，保留了诱导保护性，在外源抗原免疫应答方式上，类似于亲代株胸苷激酶突变体5。NYVAC载体作为重组疫苗传递体系，已经在动物模型系统和目标品系包括人中应用，用NYVAC表达伪狂犬病毒糖蛋白，犬肌肉注射28d后，已经检测到中和抗体7。表达的马流感A1和A2血清型血凝素糖蛋白，接种马后，产生了血凝抑制抗体5。用NYVAC表达日本脑炎病毒prM/M,E和NS1多蛋白，接种猪，检测到了血凝抑制和中和抗体8。用NYVAC表达狂犬病毒糖蛋白基因，已在鼠、猫和犬体上，不仅表现出安全性，而且能够有效地保护动物，抵抗狂犬病毒的攻击。用NYVAC表达疟原虫，免疫鼠，诱导了结合抗体和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）作用9。早期痘苗病毒转录中，缺少裂解酶，作为表达一些真核细胞的载体时，受到一定的限制，然而，此问题已通过将cDNA插入进痘苗病毒基因组中而得到解决4。目前尽管只有几千bp的基因序列插入进痘苗病毒基因组中，通常认为其容量是很大的。痘苗病毒含有1650bp片段的串联重复序列，可以装备大量的基因组，删除30kb的痘病毒突变体载体，可以提高其容量，也可以在此单一重组病毒中表达多个不同的基因9。2005, 25(12)翟新验 等： 痘病毒载体的应用中国生物工程杂志 China Biotechnology Vol.25 No.12 20052禽痘病毒重组体禽痘病毒只在禽体中复制，而在非禽品系中不复制，而且在非禽品系中已产生了有效的免疫。对痘病毒科的成员进行研究，从而可以提供品种特异的载体。例如利用禽痘病毒载体，在养禽业中，生产重组疫苗。痘病毒株用于基因工程中表达各种抗原，例如细菌、病毒和寄生虫，继而评估动物模型及目标品系动物。通过使用高致弱的缺陷病毒株，以及宿主范围限制的痘病毒，例如金丝雀痘病毒，痘病毒载体的安全性进而得以保证5。2.1禽痘病毒载体在禽类上的应用致弱的禽痘病毒疫苗，在养禽业中用于防治野生型痘病毒感染已有多年。近年来，随着基因工程的发展，利用禽痘病毒作为表达载体，表达新城疫病毒血凝神经氨酸酶和融合蛋白，将此重组疫苗免疫1日龄SPF鸡，可产生血凝抑制抗体，此抗体可维持8周时间5。但在养禽业中，应考虑两方面的影响因素:一是来自母源抗体的影响，在载体中要表达病原的基因；另一个就是禽痘病毒本身的影响。将禽痘病毒载体表达的新城疫病毒血凝神经氨酸酶和融合蛋白，免疫商品肉鸡，利用NDV强毒株肌肉注射，以及呼吸道途径攻毒，同时用禽痘病毒进行攻击，证明可以有效地保护动物5。2.2禽痘病毒载体在非禽类上的应用禽痘和金丝雀痘病毒只严格在禽体中表达，而不在哺乳动物细胞中复制。用禽痘病毒作载体生产的重组疫苗，只是欲表达的外源基因在哺乳动物身上表达并产生免疫，即诱导保护性免疫作用。从而消除了潜在的免疫载体的扩散，以及对非接种物以及环境的影响。金丝雀痘病毒作为载体制备疫苗的有效性，在诱导保护性免疫方面，较禽痘病毒作为载体制备的重组疫苗高100倍，但与胸苷激酶破裂的复制感受态痘苗病毒载体制备的重组苗相类似5。大量的试验表明，金丝雀痘病毒载体重组疫苗在实验动物和目标品系中，产生了安全免疫性和良好的保护性。较早的例子就是用金丝雀痘病毒载体表达狂犬病毒糖蛋白G。金丝雀痘病毒载体狂犬病毒糖蛋白重组疫苗已在大量非禽品系中应用，其安全性和免疫性皆很好，接种实验动物和目标品系，如猫和犬都产生了很好的保护，并已安全用于人临床试验，保护犬和人免受狂犬病毒的攻击，表现出了很好的安全性和免疫原性10,11。金丝雀痘病毒表达的麻疹病毒融合血凝素糖蛋白，较之用痘苗病毒作载体的重组疫苗，表现了对麻疹、犬瘟热相类似水平的免疫应答和保护12,13。金丝雀痘病毒载体表达猫白血病病毒完整的亚群A包膜，或删除了免疫抑制区的修饰了的包膜，或是整个gag基因，将此重组体免疫89周龄的小猫，已产生了有效的保护性。这是第一个通过痘病毒作为载体表达后免疫动物，成功地抵御了反转录病毒攻击的例证14。金丝雀痘病毒表达的另一个反转录病毒就是爱滋病的病原HIV。用ALVAC表达HIVI，HIVII gag, pol 或包膜基因，以及绿猴免疫缺陷病毒，接种啮齿类动物，不仅产生了体液免疫，而且产生了细胞毒性T淋巴细胞（CTL）作用。已经构建了一系列金丝雀痘病毒HIV株重组体，并已在人身上做临床试验，表现出了很好的安全性和免疫原性15。此外，巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)是非常重要的生殖系统传染病病原，利用ALVAC作为载体，将CMVgB接种受试者，检测到高滴度抗体和淋巴细胞增生性应答16。因此，在哺乳动物中不复制的金丝雀痘病毒，较竞争复制的痘苗病毒载体有很大的优越性。3其它痘病毒载体的应用用痘病毒载体发展的外源细菌、病毒或是寄生虫重组疫苗，是基于痘苗病毒载体表达外源基因这一技术，而逐渐发展得以在实际中应用的。可以将25kb的外源基因插入进痘病毒载体中，而且痘病毒载体可同时表达几种外源基因17。羊痘病毒作为复制缺陷型载体，已经用于表达反刍和非反刍动物病毒基因的一些蛋白，例如表达了狂犬病毒糖蛋白，以及牛瘟重组疫苗18。另外，副痘病毒也已用于生产有效、安全的活疫苗，基于副痘病毒ORFV株D1701V表达的猪疱疹病毒和伪狂犬病毒，生产的重组疫苗，经过攻毒试验，也证明可以保护动物19。虽然在兽医领域中，有的产品已获得了认证而上市，人们仍在努力研究痘病毒载体基础上的重组疫苗，进而研究其免疫诱导的各种参数，开辟更加广阔的新领域，例如癌症免疫治疗。现已研究了痘病毒基础上的重组体，表达肿瘤相关抗原，或生物应答修饰。特别值得提及的是重组表达的癌胚抗原，已在鼠、猴身上产生了抗体和细胞免疫16。设计更安全、更有效的痘苗病毒疫苗，以及以痘病毒为基础的表达载体，能够更好地理解病毒基因的功能、致病性、组织嗜性和免疫逃逸，从而能够更好地防治疾病。参考文献1 殷震，刘景华.动物病毒学第2版北京：科学出版社,1997 939987Yin ZH, Liu J H. 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Moreover, the efficacy of expressive heterologous protein is very high. Organism is stimulated to produce immune response. Pox virus vectors are important tools in genetic engineering and have a wide range of applications, which have successfully expressed many foreign genes from plants, animals, as well as human beings.Key wordsPox virus vectorsApplications(The Side Population Cells in the Adult Stem Cell PopulationsWANG HonghuiNIE JielinLI YinghuiDAI Zhongquan（Institute of Space MedicoEngineeringBeijing