肝糖原的提取、鉴定与定量.doc

生物化学实验报告姓 名： 汪煜灵 学 号： 3130010071 专业年级： 2013级临床医学 组 别： 第2实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称肝糖原的提取、鉴定、分离实验日期2014-12-25实验地点第2实验室合作者陈海玲 指导老师朱利娜评分教师签名批改日期1、 实验目的1、 掌握组织样品的制备方法，了解其注意事项。2、 了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项，掌握其操作方法。3、 正确操作使用刻度吸管和可调微量取液器。4、 熟练运用溶液混匀的各种方法。5、 正确掌握溶液转移的操作。6、 正确操作使用分光光度计。2、 实验原理l 肝糖原的提取糖原储存于细胞内，采用淹没匀浆等方法可使细胞破碎，低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性，破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质，而糖原仍稳定地保存于上清液中，从而使糖原与蛋白质等其他成分分离开来。糖原不溶于乙醇而溶于热水，故先用95%乙醇将绿叶中糖原沉淀，再溶于热水中。l 糖原的鉴定糖原水溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中，依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖，利用呈色反应和葡萄糖的还原性，可判定肝组织中糖原的的存在。CuSO4 + 2NaOH = Na2SO4 + Cu(OH)22Cu(OH)2 + C6H12O6 = 2CuOH + 氧化型葡萄糖 + H2O2CuOH = H20 + Cu2O (红色)Cu(OH)2 = H2O + CuO (黑色)l 肝糖原的定量糖原在浓酸中可水解为葡萄糖，浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物5-羟甲基呋喃甲醛，此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。该物质在620nm处有最大吸收。糖含量在10100mg范围内，溶液颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量的标准溶液比色，通过标准对照法即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中非常稳定，故在显色之前，肝组织先置于浓碱中加热，以破坏其他成分，而保留肝糖原。3、 实验材料l 仪器：1、 普通离心机，室温-100恒温水浴箱（x2），722型分光光度计，精度为 10mg级电子天平2、 剪刀、镊子、研钵3、 试管架，离心管，试管4、 刻度吸量管（2ml ,5ml），1000l微量可调取液器5、 100ml容量瓶6、 白瓷反应板l 试剂：鸡肝、95%乙醇、0.31mol/L(5%)三氯醋酸溶液、0.15mol/L NaCl溶液、浓HCl、12.5mol/L(50%)NaOH、碘试剂、班氏试剂、30%KOH溶液、标准葡萄糖液（50mg/L）蒽酮显色剂4、 实验步骤l 肝糖原的提取+5%CCl3COOH 1ml+5%CCl3COOH 3ml+蒸馏水2ml鸡肝约1.5g，剪碎 研磨至乳状研磨成肝匀浆全部转入离心管中，离心3min（4000r/min）取上清液+5ml 95%乙醇，混匀，静置10min离心5min（4000r/min）取沉淀沸水浴2min，溶解沉淀+50% NaOH 0.2ml+班氏试剂0.2ml(4d)+浓HCl 0.2ml 糖原溶液1ml白瓷板中 沸水浴加热15min，冷却 加碘试剂0.1ml 加碘试剂0.1ml 糖原溶液0.1ml糖原水解液0.1ml（2d） 糖原水解液呈色对比 混匀沸水浴2min，观察变化l 注意事项：1、 提取肝糖原时，向上清液中加入等量的95%乙醇后，必须混匀。由于上清液为水溶液，比重大于95%乙醇，溶液分成两层。加之上清液已4ml多，加上等量乙醇，总量接近9ml，混匀操作比较困难，最好用倾倒混匀，或用玻璃棒搅拌混匀。2、 糖原中葡萄糖螺旋链吸附碘产生的颜色与葡萄糖残基数的多少有关。葡萄糖残基在20个以下的会使碘呈现红色，20-30个之间使碘呈现紫色，60个以上的会使碘呈现蓝色。淀粉中分支链较长，故呈蓝色，而肝糖原分枝中的葡萄糖残基在20个以下（通常8-12个葡萄糖残基），吸附碘后呈现红棕色。3、 糖原水解液中鉴定葡萄糖时，加班氏试剂不能过量，否则反应液呈黑色浑浊，观察不到应有的结果。l 肝糖原定量测定鸡肝 0.15 g+30% KOH 1.5ml沸水浴15min冷却，全部转入100ml容量瓶中加水至标线，仔细混匀，获得糖原提取液取3支干净的试管，按下表操作：试剂（ml）空白管标准管样品管蒸馏水1.0标准葡萄糖溶液1.0糖原提取液1.00.2%蒽酮溶液2.52.52.5混匀，沸水浴10min，冷却。在722型或721型分光光度计620nm波长处，用空 白管溶液调零，测定各管溶液的吸光度（A）.计算：肝糖原（g/100g肝组织）= X 0.05 X X X 1.115、 实验现象与结果讨论l 糖原水解液加班氏试剂沸水浴后无明显变化。l 糖原溶液加碘试剂后呈红棕色，但与碘试剂原来颜色区别不大。l 鸡肝加碱沸水浴后分层，上层为红棕色，下层无色。l 加入蒽酮溶液并且水浴过后的空白管、标准管、样品管（由左至右）对比l 将空白管在620nm处的A值设定为0，测得标准管、样品管的A值如下：空白管标准管样品管100.6100.085200.6120.085300.6160.091平均值00.6130.087肝糖原（g/100g肝组织）= X 0.05 X X X 1.11 0.525从肝糖原的定量