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非水相催化课件,非 水 相 酶 催 化,enzymatic catalysis in non-aqueous system,非水相催化课件,内 容,第一节 非水酶学概述 第二节 非水介质中酶的结构与性质 第三节 水对有机介质中酶催化的影响,非水相催化课件,第一节 非水酶学概述,传统观念认为酶只能在水溶液中发挥作用，而一旦和有机溶剂接触则失去活性。有关酶的催化理论是基于酶在水溶液中的催化反应建立起来的。 但对于大多数有机化合物来说，水并不是一种适宜的溶剂。许多有机化合物底物在水介质中难溶或不溶。 是否可以在非水介质中能够保证酶催化？,非水相催化课件,一、非水相酶学的研究历史,非水相催化课件,非水相催化课件,水相和非水相酶的催化反应,非水相催化课件,二、非水相酶催化的特点和优势,(8) 改变酶选择性，包括底物专一性、对映和区域选择性,非水相催化课件,非水相催化课件,三、非水相酶催化的主要类型,（一）有机介质的酶催化； （二）气相介质的酶催化； （三）超临界流体介质中的酶催化； （四）离子液介质中的酶催化,非水相催化课件,（一）有机介质的酶催化,指酶在含有一定水的有机溶剂中进行催化反应。 1、水不互溶有机溶剂单相体系（微水有机介质体系） 2、水互溶有机溶剂单相体系 3、水- 有机溶剂两相系统； 4、胶束和反相胶束体系,非水相催化课件,1、水不互溶有机溶剂单相体系 （微水有机介质体系）,是指用水不互溶有机溶剂（含量98%）取代几乎所有的水，微量水一部分为酶分子的结合水，才能保证其空间构象和催化活性。 酶以冻干粉或固定化酶的形式悬浮于有机溶剂中，在悬浮状态下进行反应。 水不互溶性有机溶剂通常是烷烃类、芳香族化合物、卤代烃、醚等。,非水相催化课件,2、水互溶有机溶剂单相体系,是指由水和与水互溶的有机助溶剂（1020%）组成的反应体系，酶、底物、产物均能溶解于该体系中。 主要适用于在单一水溶液中溶解度很低、反应速度也很慢的亲脂性底物的生物转化。 常用的有机溶剂有二甲基亚砜（dmso）、二甲基甲酰胺(dmf)、四氢呋喃(thf)、二噁烷、丙酮和低级醇。,非水相催化课件,3、水- 有机溶剂两相系统,指由水和疏水性较强的有机溶剂组成的两相体系。疏水性底物和产物溶解于有机相中，酶溶解于水相中。 由于双相体系中的酶催化反应是在水相中进行，必须保证反应底物和产物在酶与两相之间又良好的质量传递条件，因此振荡和搅拌将是该生物催化反应体系中最重要的参数。 常使用的水不溶性溶剂有烃、醚、酯等。一般应用于强疏水性的底物，如甾体类、脂类和烯烃类生物转化。 通过选择适当的有机溶剂以及适度的水相调节（如ph、盐浓度）可以控制反应物在两相中的分配，进而缓解匀相系统中底物或产物的抑制。,非水相催化课件,4、胶束和反相胶束体系,反相胶束体系是含有表面活性剂与少量水的有机溶剂系统。 当体系中水浓度高于有机溶剂时，形成胶束的极性端朝向外侧，有机溶剂被包在胶束内部，称为正相胶束。当体系中水浓度低于有机溶剂时，形成胶束的极性端朝向胶束中部，而非极性端朝向胶束外侧，水被包在胶束的内部，称为反相胶束。,非水相催化课件,正胶束体系,非水相催化课件,反相胶束体系,反相胶束：在与水不互溶的大量有机溶剂中，加入表面活性剂后形成的油包水的微小水滴。,非水相催化课件,常用表面活性剂：aot 丁二酸二（2-乙基）己酯磺酸钠、tween 酶被限制在含水的微环中，而底物和产物可以自由进出胶束。,非水相催化课件,小结,非水相催化课件,（二）气相介质的酶催化,指酶在气相介质中进行催化反应； 适用范围：底物是气体或能转化为气体的物质； 优点：某些酶在液相中使用受到一定限制，如酶和辅酶的操作不稳定性，底物及产物的不溶性和酶的活性被产物抑制等，而气相中的反应可以克服这些缺点。,非水相催化课件,（三）超临界流体介质中的酶催化,超临界流体指温度和压力超过临界点的流体。 常用的超临界流体有：co2、氟利昂（cf3h）、 烷烃类（甲烷、乙烯、丙烷）或无机化合物 （so2、n2o）。酶在这些溶剂中就像在亲脂 性有机溶剂中一样稳定。,非水相催化课件,非水相催化课件,（四）离子液介质中的酶催化,指酶在离子液中进行催化作用； 离子液(ionic liquids)是有机阳离子、有机阴离子在室温下呈液态低熔点盐类。 特性：酶在其中有良好的稳定性、区域选择性、立体选择性、键选择性。,非水相催化课件,四、非水相酶催化的主要研究内容,非水介质中酶学基本理论研究，包括酶学性质、影响非水介质中没催化的主要因素以及酶作用动力学； 通过对酶在非水介质中结构与功能的研究，阐明非水介质中酶的催化机制，建立和完善非水酶学的基本理论 利用基本理论来指导非水介质中酶催化反应的研究和应用。,非水相催化课件,第二节 非水介质中酶的结构与性质,一、非水介质中酶的结构 （一）非水介质中酶的状态 固态酶：包括冷冻干燥的酶粉或固定化酶，它们以固定形式存在有机溶剂中。 可溶性酶：包括水溶性大分子共价修饰酶和非共价修饰的高分子-酶复合物、表面活性剂-酶复合物以及微乳液中的酶等。,非水相催化课件,一、非水介质中酶的结构,（二）活性位点和机制 在有机相中酶能够保持其整体结构的完整性，酶活性部位与水溶液中的结构式相同。 有机溶剂中酶反应机制与水溶液中的酶反应机制相同。如在有机溶剂中的酶促转酯反应遵循米氏方程；酶在有机溶剂中的最大催化活力对应的ph也是酶在水溶液中的最佳ph。,非水相催化课件,（三）有机溶剂中酶分子的柔性 在非水溶剂中酶所需的水能给予酶分子在构象上有足够的柔性而使其具有催化活性。 酶分子的“紧密”和“开启”；两种状态处于一个动态平衡，表现出一定柔性。 不同介质中酶活性中心的完整性相差不大，但酶活力却相差4个数量级。因此认为酶分子的动态变化很可能是主要因素。,非水相催化课件,刚性与柔性的动态平衡,紧密状态：取决于蛋白质分子内的氢键 溶液中水分子与蛋白质分子之间所形成的氢键使蛋白质分子内氢键受到一定程度的破坏，蛋白质结构变动松散，呈一种“开启”状态。,（蛋白质与水分子之间）,非水相催化课件,二、非水介质中酶的性质,1、酶的稳定性提高 酶的热不稳定性分为两种情况：一种是当酶处于高温中随着时间延长逐步发生的不可逆的失去活性；另一种是由热诱导产生的瞬间和可逆的酶分子去折叠。无论是哪一种失活方式，水在其中均起到非常关键的作用。,非水相催化课件,2、酶的特异性发生变化,对于一个给定的酶来说，选择性被看成是酶的固有特性，要改变其选择性，就要改变酶分子自身，比如通过定点突变。只要酶是在水中发挥作用，或者说当反应介质固定不变时，这一概念就是正确的。但当酶催化过程是在有机溶剂中进行时，当从一个溶剂中换到另一种溶剂中时，酶的各种选择性都会发生深刻的变化。,非水相催化课件,2、酶的特异性发生变化,底物选择性： 指酶区分两个结构相似的不同底物的能力。它取决于底物疏水性的差异。 溶剂的改变会引起底物在水与有机溶剂两相分配系数的改变，从而导致在有机溶剂中底物专一性的改变。 如，疏水性底物n-乙酰-l-苯丙氨酸乙酯在水中对-凝乳蛋白酶的反应性比亲水性底物n-乙酰-l-丝氨酸乙酯高5万倍，而在辛烷中苯丙氨酸底物的反应性反而只有丝氨酸底物反应性的1/3。,非水相催化课件,2、酶的特异性发生变化,底物选择性： 枯草芽孢杆菌蛋白酶催化n-乙酰-l-苯丙氨酸乙酯或n-乙酰-l-丝氨酸乙酯与丙醇的酯交换，在水和有机溶剂中的选择性与底物在两相中的分配系数有关。,非水相催化课件,2、酶的特异性发生变化,对映选择性： 酶的立体选择性随有机介质的不同而发生改变。 关于溶剂影响酶选择性的最有说服力的例子是日本名古屋田野公司对硝基地平（1-取代的二氢吡啶单酯或双酯）的研究。,非水相催化课件,假单胞菌脂肪酶催化二氢嘧啶二羧基酯类衍生物选择性水解产生二羧酸单酯。相同酶在不同有机溶剂体系中反应所得产物的构型相反。,非水相催化课件,2、酶的特异性发生变化,区域选择性： 指酶对底物分子中几个相同官能团中的一个具有优先反应能力。 2-辛集-1,4-苯二酚二丁酸酯与醇的转酯化反应，1-位上被醇解的速率和4-位上醇解的速率随溶剂疏水性变化而大不相同。,非水相催化课件,化学键选择性： 酶选择性的催化底物分子中化学性质不同的官能团中某个基团。 如6-氨基-1-己醇的化学酰化反应中氨基的反应性较羟基高而优先被酰化，但用黑曲霉脂肪酶催化的结果却正好相反，即羟基占绝对优势，这使得不用保护基而制备氨基醇单酸酯成为可能。,2、酶的特异性发生变化,非水相催化课件,所有这些特异性的变化都与“分配”有关，即底物、对映体、基团等在有机溶剂和水中的分配,非水相催化课件,第三节 水对有机介质中酶催化的影响,酶都溶于水，只有在一定量的水存在的条件下，酶分子才能进行催化反应。所以酶在有机介质中进行催化反应时，水是不可缺少的成分之一。有机介质中的水含量多少对酶的空间构象、酶的催化活性、酶的稳定性、酶的催化反应速度等都有密切关系，水还与酶催化作用的底物和反应产物的溶解度有关。,非水相催化课件,第三节 水对有机介质中酶催化的影响,一、必需水- 水对酶分子空间构象的影响 维持酶分子完整空间构象所必需的最低水含 量成为必需水。 酶分子只有在空间构象完整的状态下，才具 有催化功能。在无水的条件下，酶的空间构象被 破坏，酶将变性失活。必需水是酶在非水介质中 进行催化反应所必需的，它会直接影响酶的催化 活性和选择性。,非水相催化课件,非水相催化课件,非水相催化课件,不同的酶所需求的必需水的量差别较大。如每分子胰凝乳蛋白酶只需50分子的水，每分子多酚氧化酶却需要3.5102个水分子。,非水相催化课件,二、水对酶催化反应速度的影响,水使酶具有一定的柔性 无水时酶为绝对刚性，是没有活性的。有少 量水则柔性增加，活性恢复，水分增加到一定程 度后继续增加对活性的提高没有促进。 典型的非水酶体系中水含量通常0.1%，但 其微小差距会导致酶催化活力的较大改变。水影 响蛋白质结构的完整性、活性位点的极性和稳定 性。,非水相催化课件,非水相催化课件,猪胰脂肪酶催化三丁酸甘油酯转酯反应 过程中反应速度与水浓度之间的关系,非水相催化课件,非水相催化课件,非水相催化课件,有机介质中有两类水：结合水、游离水； 在结合水不变的条件下，体系含水量的变化对酶催化活性影响不大；然而在一些体系中，溶剂和底物性质对酶活力也有直接或间接影响。 为了排除溶剂对最适含水量的影响，halling建议用水活度（aw）描述有机介质中酶催化活力与水的关系：,三、水活度（activity of water）,非水相催化课件,水在反应系统中的分配与平衡,水在反应体系会发生分配， 这种分配导致直接以溶剂中的水含量计算酶的结合水会出现误差，以水活度计算才比较准确。,非水相催化课件,三、水活度（activity of water）,1、定义：一定温度和压力下，体系中水的逸度与纯水逸度之比； 用体系中水蒸汽压与相同条件下纯水蒸汽压之比表示： aw=p/po p：一定条件下体系中水的蒸汽压 po：相同条件下纯水的蒸汽压 水活度与溶剂极性大小无关，故采用水活度作参 数更确切。,非水相催化课件,三、水活度（activity of water）,2、水活度与酶的活性 酶活性与反应体系的aw直接相关，如米黑毛霉脂肪酶在aw=0.55时，在不同极性的溶剂中都表现出最高的酶活性，其中在正己烷溶剂中活性最强，有机溶剂中过多的水或过少的水都会影响酶活性。 水对非水相酶活力有影响，对立体选择性有一定的调节作用。,非水相催化课件,三、水活度（activity of water）,aw对酶的立体选择性也有影响。如皱褶假丝酵母脂肪酶在有机溶剂正己烷中催化2-溴丙酸酯生产r或s- 2-溴丙酸正丁酯。随着溶剂中水含量的逐渐增加，酶的对映选择性显著增强。,非水相催化课件,三、水活度（activity of water）,3、水活度的调控 饱和溶液平衡法：将酶与盐的饱和溶液平衡，含有底物的溶剂平衡至相同的水活度。,非水相催化课件,三、水活度（activity of water）,3、水活度的调控 高水合盐调节法：向干燥的反应体系中直接加入一种高水和盐。如nahpo412h2o变为nahpo42h2o时向反应体系释放水。,非水相催化课件,第四节 有机溶剂对有机介质中酶催化的影响,有机溶剂的影响：酶活力下降,非水相催化课件,1. 有机溶剂对酶结构的影响,在水溶液中酶分子均一地溶解在水溶液中，较好地保持其构象； 有机溶剂中酶分子不能直接溶剂，因此根据酶分子特性与有机溶剂特性不同，其空间结构的保持也有不同； 有些酶在有机溶剂中作用下，其结构受到破坏；有的酶分子则保持完整。,非水相催化课件,1. 有机溶剂对酶结构的影响,由于酶分子与溶剂的直接接触，蛋白质分子表面结构发生不可忽视的变化； 通过减少整个活性中心的数量，溶剂对酶的活性中心产生影响，溶剂与底物竞争酶的活性中心结合位点；而且溶剂分子能渗透酶的活性中心，降低活性中心的极性，增加酶与底物的静电斥力，因而减低了底物的结合能力。,非水相催化课件,2. 有机溶剂对酶的结合水的影响,酶在不同的有机溶剂中活力差别很大，原因在于有机溶剂能够夺取酶表面的“必需水” ，产生溶剂“扭曲（或扰动）”效应； 并且这种能力与有机溶剂的疏水性（极性）密切相关：极性越强，“扭曲”越强。因此，非极性溶剂不会扰动酶的“必需水”层，有利于酶发挥其催化活性。,非水相催化课件,3、有机溶剂对底物和产物的影响,溶剂能直接或间接地与底物和产物相互作用。 溶剂对底物和产物的影响主要体现在底物和产物溶剂化上，从而影响反应动力学和热力学平衡。,非水相催化课件,3、有机溶剂对底物和产物的影响,溶剂能改变酶分子必需水层中底物或产物的浓度。 （1）有机溶剂极性小，疏水性强，疏水性底物难于进入必需水层； （2）有机溶剂极性过强，亲水性强，疏水性底物在有机溶解度太低； （3）故选择中等极性的有机溶剂作为反应介质可达到较高的反应速率，但在中等极性的溶剂中，酶比较容易失活。利用可以紧密结合水的载体对酶进行固定化，可以避免有机溶剂对酶结合水层的扰动，因此同样可以获得较高的酶活和酶稳定性。,非水相催化课件,4、有机溶剂对酶选择性的影响,非水相催化课件,第五节 有机溶剂中酶催化反应的类型,一、合成反应 二、转移反应 三、醇解反应 四、氨解反应 五、异构反应 六、氧化还原反应 七、裂合反应,非水相催化课件,一、合成反应,非水相催化课件,1、采用热稳定性脂肪酶催化脂肪酸和烷基吡喃葡萄糖苷缩合； 2、反应过程中生成的水需通过减压蒸馏的除去； 3、底物分子中r1基团的改变会影响酶催化反应的产率。,非水相催化课件,非水相催化课件,二、酰基转移反应,严格控制含水量； 采用过量酰基供体和选用特殊酰基供体抑制逆反应的方法提高反应速率，减少副反应。,非水相催化课件,三、醇解反应,醇解反应：酸酐、酯等被醇分解，生成酯和其他化合物的反应。,非水相催化课件,四、氨解反应,不可逆反应,非水相催化课件,五、异构反应,-胺基-己内酰胺是制造光活性的赖氨酸的重要中间体,非水相催化课件,六、氧化还原反应,（1）单加氧 （2）双加氧 （3）催化醛类或酮类还原成醇类 与水解酶相比，氧化还原酶如脱氢酶和氧化酶在有机溶剂体系中使用较少，因为它们需要辅酶。,非水相催化课件,（1）单加氧、 （2）双加氧,非水相催化课件,（3）催化醛类或酮类还原成醇类,非水相催化课件,第六节 有机介质中酶催化反应的条件及其控制,酶在有机介质中的催化反应受各种因素影响，主要由酶、底物、有机溶剂种类、水含量、温度、ph值和离子强度等。,非水相催化课件,一、酶的选择 不同的酶具有不同的结构和特性，同一种酶，由于来源的不同和处理方法的不同，其特性也有所差别，所以要根据需要通过试验进行选择。 在酶催化反应时，通常酶所作用的底物浓度远远高于酶浓度，所以酶催化反应速度随着酶浓度的升高而升高，两者成正比。,非水相催化课件,二、底物的选择和浓度控制 由于酶在有机介质中的底物专一性与在水溶液中的专一性有些差别，所以要根据酶在所使用的有机介质中的专一性选择适宜的底物。 在底物浓度较低的情况下，酶催化反应速度随底物浓度的升高而增大。当底物达到一定浓度以后，再增加底物浓度，反应速度的增大幅度逐渐减少，最后趋于平衡，逐步接近最大反应速度。,非水相催化课件,三、有机溶剂的选择 有机溶剂的极性选择要适当，极性过强的溶剂，会夺取较多的酶分子表面结合水，影响酶分子的结构，并使疏水性底物的溶解度降低，从而降低酶反应速度，在一般情况下不选用； 极性过弱的溶剂，虽然对酶分子必需水的夺取较少，疏水性底物在有机溶剂中的溶解度也较高，但是底物难于进入酶分子的必须水层，催化反应速度也不高。,非水相催化课件,四、水含量的控制 有机介质中，水的含量对酶分子的空间构象和酶催化反应速度有显著影响。 要通过试验确定反应体系的最适水含量。 最适水含量与溶剂的极性有关，通常随溶剂极性的增大，最适水含量也增大；而达到最大反应速度的水活度却变化不大，都在0.50.6之间。 在实际应用时应当控制反应体系的水活度在0.50.6的范围内。,非水相催化课件,五、温度控制 温度是影响酶催化作用的主要因素之一。 在微水有机介质中，由于水含量很低，酶的热稳定性增强，所以其最适温度高于在水溶液中催化的最适温度。但温度过高，同样会使酶的催化活性降低，甚至引起没得变性失活。 酶与其他非酶催化剂一样，温度升高时，其立体选择性降低。这一点在有机介质的酶催化过程中显得特别重要。,非水相催化课件,六、ph值的控制 酶在有机介质中催化的最适ph值通常与在水溶液中催化的最适ph值相同或者接近。 在有机介质中，酶的催化活性与酶在缓冲溶液中的ph值和离子强度有密切关系。 酶分子从缓冲溶液转到有机介质后，酶分子保留了原有的ph印记。 通过调节缓冲溶液ph和离子强度的方法对有机介质中酶催化的ph值和离子强度进行调节控制。,非水相催化课件,第七节 非水介质酶催化的应用,非水相催化课件,一、手性药物的拆分,手性药物指只含单一对映体的药物； 已经发现很多手性药物的对映体具有不同的药理作用。 过去手性药物较多是以消旋体形式出售的。 1961年欧洲出现了孕妇服用多消旋体的“反应停”后，产生多起畸形胎事件。 1992年美国食品与药物管理局（fda）明确要求含手性因素的化学药物，必须说明其二个对映体在体内的不同生理活性，药理作用和药物代谢动力学情况。 1994年以来，手性药物世界销售额以年20%以上的速度增长。 目前，世界上批准上市约61种。,非水相催化课件,手性药物两种对映体的药理作用,非水相催化课件,酶在手性化合物拆分方面的应用,（1）环氧丙醇衍生物的拆分：2,3-环氧丙醇单一对映体的衍生物是一种多功能手性中间体。它可以用于合成-受体阻断剂、艾滋病病毒蛋白酶抑制剂、抗病毒药物等多种手性药物，其消旋体可以在有机介质体系中用酶法进行拆分，获得单一对映体。,非水相催化课件,酶在手性化合物拆分方面的应用,芳基丙酸衍生物的拆分：2-芳基丙酸是手性化合物，其单一对映体衍生