盐胁迫下外源NO供体对白皮黄瓜种子萌发的影响1_-_副本.doc

盐胁迫下外源NO供体对白皮黄瓜种子萌发的影响前言 人均土地资源和淡水的日益缺乏制约着经济和社会的可持续发展,全球约 33% 的农业用地遭受着盐碱化的影响 , 其中Na 和Cl 是最普遍的盐害离子 .耕地盐碱化降低了农作物的产量,增加了对灌溉装置 的需求,消耗了更多的人力、物力和财力. 寻找抗盐或耐盐性作物, 利用其本身的抗盐特性成为解决这一问题 的重要出路之一.另一方面,也可通过转基因技术把抗盐植物的耐盐关键基因转入作物中提高作物的抗盐性. 对于拥有 18000km漫长海岸线和20779km 沿海滩涂而承受着巨大人口压力的中国来说,发展海水灌 溉农业,其经济、社会和生态意义是可想而知的.多年来的农作物灌溉,消耗了大量宝贵的淡水, 而随着工业社会的迅猛发展,淡水用量猛增且受到污染程度日渐加重,淡水成了制约城市发展和农业生产丰收的瓶颈因 素,这一点在沿海地区表现更加明显.通过对植物抗盐机制的研究,采取合适的技术增强植物抗盐性,发展海 水灌溉农业,经济价值是难以估价的 .近年来,一氧化氮(NO)作为信号分子的研究备受关注. 已证明, NO在植物生长、发育、衰老、细胞程序 一、实验目的1、探究盐胁迫下，不同浓度的SNP溶液处理白皮黄瓜种子对其萌发的影响。2、测定a-淀粉酶的变化及萌发过程中吸水情况。3、测定处理后种子的发芽率、发芽势。4、细胞膜透性的测定(以相对电导率表示)。二、材料、仪器 白黄瓜种子、0.1%的氯化汞溶液、蒸馏水、SNP溶液培养皿、带塞的三角瓶、滤纸、培养箱。三、实验过程 、处理 1、取饱满、无病害的白皮黄瓜种子，用0.1%的氯化汞溶液消毒10min,再用蒸馏水冲洗干净在盐浓度为250mmol/L（参考王春林等盐胁迫对甜瓜种子萌发的影响）的培养皿中28摄氏度暗箱浸泡所需的黄瓜种子（参考王春林等盐胁迫对甜瓜种子萌发的影响）。 2、设0mmol/L（只加蒸馏水）、0.01mmol/L、0.1mmol/L、1.0mmol/L的SNP溶液浓度梯度（张秀玮，董元杰等外源NO 对不同作物种子萌发、幼苗生长及抗氧化酶活性的影响）。、实验过程实验分为三部分。第一，测定种子萌发是的吸水率和发芽率发芽势（需800粒种子）。具体过程是取用盐浓度浸泡过的饱满、无病害的白皮黄瓜种子，放入有不同SNP浓度的培养皿，每皿200粒，浸泡15h、（参考参考运城生命科学院王霞的研究）。晾干，在铺有两层滤纸的培养皿中保湿25恒温培养。早晚浇SNP溶液10mL(张秀玮，董元杰等外源NO 对不同作物种子萌发、幼苗生长及抗氧化酶活性的影响)，保湿，发现有霉变种子，及时剔除。自培养之日起测种子吸水率并记录，选取自然风干的种子、处理后1、2、4、8、12、24、48h的种子各50粒称重(精度为0. 001 g 的电子秤) ,3次重复。种子的吸水率按下式计算:W (% ) = (W1 - W2 ) /W2 * 100式中: W1为50 粒种子鲜质量, W2为50 粒种子自然风干质量（参考王春林等盐胁迫对甜瓜种子萌发的影响）。3-5天后发芽。自发芽之日起, 每天记录发芽种子粒数(胚根突出种皮视为发芽)。计算发芽率(以浸种后放入培养皿的次日开始, 每天记录发芽粒数, 至萌发结束即第7 d。发芽率= 发芽种子数/供试种子数* 100% ) 和发芽指数(发芽指数= (Gt /D t), 其中, Gt为t日内的发芽数,D t为相应的发芽天数)。SNP（mmol/L）发芽率%发芽势%发芽指数SNP溶液处理时间（h）15h15h15h00.010.11.0 表1 SNP 对白皮黄瓜种子萌发的影响第二，测定a-淀粉酶（需粒种子）（1）测定原理 测定淀粉酶活力的方法主要根据支链淀粉或可溶性淀粉经酶分解后还原力提高；淀粉酶分解后碘染色性质的改变。 （2）仪器设备 分光光度计、pH计、匀浆器、恒温水浴等。 （3）材料和试剂1、材料 含淀粉的植物种子。2、试剂 、50mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH=7.0） 内含3mmol/L氯化钙和4mmol/L NaCl。、B-极限糊精 1g马铃薯淀粉加入2ml蒸馏水调匀，倾入30ml沸水中，煮沸并搅拌2min,冷却至室温。另取50mlB-淀粉酶（不带a-淀粉酶）加5ml蒸馏水溶解。加入上述淀粉溶液，调至pH=4.5，然后定容至50ml加入甲苯10滴，摇匀，再30摄氏度下放置24h,放入冰箱保存，1-2周内可用。用时取出回升到室温。、0.3gKI溶于少许水中，加0.1g碘使溶解定容到100ml。、50mmol(pH3.6） 内含1mmol/L EDTA。、1%的马铃薯淀粉液 称1g3,5-二硝基杨酸，20ml2N NaOH,50ml水，30g酒石酸钾钠，溶解后水定容到100ml。暗中保存，并防止与二氧化碳接触。(5)操作方法1、粗酶液制备 黄瓜种子在暗30摄氏度下萌发7天，将子叶分离出来。 2、a-淀粉酶的活力测定 0.2ml极限糊精加0.2ml酶液再37摄氏度保温5min，加入0.5ml碘-KI溶液是反应停止。再加2ml水，然后在620nm处测定光密度。对照以pH7.0Tris-HCl缓冲液代替酶液。规定在620nm引起光密度降低10%定为1个酶活单位。（参考颜启传等主编的种子活力测定原理和方法一书）（发芽后48小时，测a-淀粉酶，每隔两天测一次，总共测3次。参考宋亮等不同化学试剂处理对甜玉米种子萌发及幼苗生长的影响）具体步骤：处理后第三，细胞膜透性的测定（需2250粒种子） 分别取处理后1、2、4、8、12、24、48 h的种子各20粒, 小心剥去种壳,用蒸馏水冲洗1次, 再用去离子水冲洗2次, 用滤纸吸干其表面浮水, 装入小烧杯中, 加入15mL去离子水, 用真空抽气泵抽气30 m in 后在室温下静置20m in, 测定初始电导率Ax, 然后在沸水中煮10 m in,冷却至室温再测其煮后电导率Bx。以相对电导率表示细胞膜透性。细胞膜透性(% ) = Ax /Bx * 100（参考王春林等盐胁迫对甜瓜种子萌发的影响）。 参考文献：1、 德州学院生物系李妍NaCl胁迫对苏丹草种子萌发及幼苗生长的影响。2、 王春林 张玉鑫 陈年来NaCl胁迫对甜瓜种子萌发的影 3、 衡水学院生命科学学院崔兴国、时丽冉NO供体SNP对黄芪种子萌发和幼苗生长的影响4、 宋 亮、 洪狄俊 、葛忠德、 詹生华不同化学药剂处理对甜玉米种子萌发及幼苗生长的影响5、 运城学院生命科学系王 霞水杨酸、硝普钠浸种对玉米种子发芽率的影响。6、 山东农业大学资源与环境学院张秀玮，董元杰* ，邱现奎，王全辉，王艳华，胡国庆外源NO 对不同作物种子萌发、幼苗生长及抗氧化酶活性的影响。7、 生物资源保护与利用湖北省重点实验室，厦门大学生命科学学院肖 强、郑海雷外源NO对盐胁迫下小白菜种子萌发的影响。8、 （黔南