05 生物化学实验--聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质.doc

聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质 【目的】 1 掌握圆盘电泳分离血清蛋白的操作技术。 2 熟悉 聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理。 【原理】 带电粒子在电场中向着与其自身电荷方向相反的电极移动，称为电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳（ PAGE ）就是以聚丙烯酰胺凝胶作为电泳介质的电泳。在电泳时，蛋白质在介质中的移动速率与其分子的大小，形状和所带的电荷量有关。 聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，是由丙烯酰胺（ Acr ）单体和少量交联剂 N,N- 亚甲基双丙烯酰胺（ Bis ）在催化剂 过硫酸铵（ Ap ） 和加速剂 四甲基乙二胺（ TEMED ） 的作用下发生聚合反应而制得的（其化学结构式见第 2 篇第 1 章）。 聚丙烯酰胺凝胶具有网状结构，其网眼的孔径大小可用改变凝胶液中单体的浓度或单体与交联剂的比例来加以控制。根据血清蛋白分子量的大小，学生实验一般选用 7 聚丙烯酰胺凝胶分离血清蛋白质。 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳利用浓缩效应、分子筛效应和电荷效应的三重作用分离物质（见第 2 篇第 1 章）， 使样品分离效果好， 分辨率较高。一般醋酸纤维薄膜电泳只能把血清蛋白质分离出 5 7 条带，而聚丙烯酰胺凝胶电泳却能分离出十几条到几十条来（图 3-4 ），是 目前较好的支持介质， 应用十分广泛。 图 3-4 血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱 根据凝胶支持物的形状不同，分为垂直板电泳和盘状电泳两种，二者原理相同。本实验采用的盘状电泳是在直立的玻璃管中，以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，采用电泳基质的不连续体系，使样品在不连续的两相间积聚浓缩（浓缩效应）成厚 度 为 10 -2 cm 的起始区带，然后再利用 分子筛效应和电荷效应的双重作用在分离胶中 进行电泳分离。 【器材】 1 电泳仪 直流稳压电源，电压 400 500V ，电流 50mA 。 2 垂直管型圆盘电泳装置 目前这类装置的种类很多，可根据不同的实验要求选择其中的一种。这类装置均由两个基本的部分组成，一部分为载胶玻璃管，须选用内径均匀（ 5 6mm ） , 外径 7 8mm ，长 80 100mm 的玻璃管作为材料，也可以使用更细的玻璃管。另一部分为电泳液槽，可分为上下两槽 。电泳时，上下两槽通过凝胶柱沟通电流（图 3-5 ）。 图 3-5 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图 (A 为正面， B 为剖面 ) 3 大号试管和中号试管 4 微量移液器 5 5ml 注射器和 9 号注射针头 6 洗耳球、滤纸条、封口膜等 【试剂】 1 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺 一般性的分析工作，用分析纯的 Acr 和 Bis 即可，精细的分析工作，尤其是分子量的测定和定量分析，需商品 Acr 和 Bis 进行重结晶，进一步纯化。 2 N ， N ， N ， N 四甲基乙二胺（ TEMED ） 商品 TEMED 即可，低温，避光保存。 3 10% 过硫酸铵溶液（ AP ， W/V ） 10g 过硫酸铵定容到 10ml ，最好使用新鲜配制的溶液。 4 染色液 取三氯乙酸 200 g 加水 500ml ，然后加入 10 g 考马斯亮蓝 R 250 用玻璃棒搅拌，待完全溶解后，再加入蒸馏水加至 1000ml 。 5 脱色液的配制 取三氯乙酸 100 g 加蒸馏水溶解后加至 1000ml 。 6 储备液的配制 电极缓冲液、凝胶缓冲液及凝胶储备液配制见下表： 浓缩胶 缓冲液 Tris 5.98g 1mol/L HCl 48ml 加蒸馏水至 100ml PH 6.7 凝胶储液 Acr 30.0g Bis 0.8g 加蒸馏水至 100ml 分离胶 缓冲液 Tris 36.3g 1mol/LHCl 48ml 加蒸馏水至 100ml PH 8.9 凝胶储液 Acr 30.0g Bis 0.8g 加蒸馏水至 100ml 10 电极缓冲液 Tris 6g Gly 28.8g 加蒸馏水至 1000ml PH 8.3 储液配制好后放冰箱 4 冷藏备用，用时 10 倍稀释，学生用时大约 3 天需更换一次。 7 凝胶液的配制 分离胶和浓缩胶的配制见下表： 7% 分离胶配制（ ml ） 3% 浓缩胶配制（ ml ） 双蒸水 13.5 双蒸水 5.7 凝胶储液 7 凝胶储液 1 PH 8.9 缓冲液 7.5 PH 6.7 缓冲液 1.3 1%TEMED 2 1%TEMED 2 总体积 30 总体积 10 8 20% 蔗糖 100ml 取蔗糖 20g ，加少许蒸馏水溶解，最后加至 100 ml 。 9 加样缓冲液的配制 ( PH6.7 ) 取 1mol 盐酸 4.8 ml ， Tris 0.6g ， 20% 蔗糖溶液 40ml ，加水至 80ml 充分混匀后，再加入 0.02g 溴酚蓝， 4 保存备用。 【操作】 1 凝胶系统的聚合和制备 一般先制备分离胶，然后再在分离胶上面制作浓缩胶。 （ 1 ）电泳玻璃管的准备 取一根洁净的电泳玻璃管，垂直放在青霉素瓶盖的凹穴中或用封口膜密封，备用。 （ 2 ）分离胶（小孔胶）的制备 取分离胶 3ml 放入试管，加入 100l 10% Ap 溶液混匀后使用。 用微量移液器抽取胶液小心迅速加入到玻璃管内，当加到液面距离电泳玻璃管上口 2cm 时停止（约 1.6ml ）。注意在加的过程中不要混进空气，用过的注射器和针头要及时用水清洗，防止堵塞。 再在其上面小心覆盖 0.5cm 高的蒸馏水层（约 0.2ml ）以隔绝空气，并防止柱表面的弯月面。加水过程中不要用力过猛，防止将液面胶液冲起。刚加入水层时在水层和胶面的交接处可见一明显的折光面，此折光面会逐渐消失，等再次出现时标志分离胶聚合已经开始，应使玻璃管垂直静置约 1520 分钟后，完成凝胶的聚合过程。然后用滤纸小心吸去表面的水层，切勿破坏胶面的完整性。 （ 3 ）浓缩胶（大孔胶）的制备 取浓缩胶 1ml 放入试管，加入 50l 10%Ap 溶液混匀后使用。 用微量移液器吸取少量浓缩胶缓冲液漂洗一下分离胶的胶面，用滤纸吸取残留的缓冲液，滤纸尽量不要接触胶表面。 再加入约 1cm 高的浓缩胶（约 0.25ml ），表面也覆盖一层蒸馏水。刚加入水层时在水层和胶面的交接处可见一明显的折光面，此折光面会逐渐消失，等再次出现时标志浓缩胶聚合已经开始，聚合 2030 min 后除去上面的水层，同样不要破坏胶面的完整性。 吸去水层后用电泳缓冲液漂洗胶面，再用电泳缓冲液注满至管口，在室温下放置 1020 min 后即可使用了。 2 样品的制备和点样 （ 1 ）样品的准备：取兔血清 0.5ml ，加入 3ml 加样缓冲液混合。可在 4 冰箱保存 2 周。 （ 2 ）点样：将制好的胶管装入电泳槽中调节高度并塞紧，防止电泳中产生漏液。然后分别在电泳槽的上下槽体内注入电泳缓冲液，下槽的液面应没过玻璃管的下管口（注意不要有气泡存在）和电极丝；上槽的液面应没过玻璃管口 0.5 1cm 。用微量注射器吸取 50l 样品；标准蛋白样品 1 份（蛋白质含量 1mg/ml ，溶于加样缓冲液中）小心的加入玻璃管内，注意不要让样品溢出管口。 4 电泳 （ 1 ）电流电压条件 圆盘电泳：直流稳流电流强度通常为 4mA/ 管 。 （ 2 ）电泳时间 一般约需 3 小时。样品中溴酚蓝电泳至距分离胶前缘约 1cm 处时即可停止电泳。 5 剥胶 电泳结束后，取下玻璃管，用带长针头的注射器（内盛蒸馏水）从浓缩胶一端紧贴玻璃管壁缓慢插入针头，一面注入蒸馏水一面缓慢旋转玻璃管。靠水流的压力和润滑作用使凝胶和玻璃管的内壁分开，待水流从另一端流出时，再慢慢将针头退出（注意操作中不要把胶条搅碎）。然后用洗耳球轻轻在胶管的一端加压，将胶条从玻璃管中缓慢滑出。 6 染色和脱色 剥胶完毕后，将胶条放入染色液中过夜（ 16 小时以上）。 将胶条以自来水冲洗两次，然后在脱色液中脱色约 5 分钟，共两次。 7 结果分析 脱色完全后，从脱色槽中取出凝胶（小心折断或撕裂），观察区带的数量及迁移率。如果需定量，可进行区带扫描，计算出各区带中蛋白质的含量。 【注意事项】 1 制胶时必须以封口膜将管下口封严密，加 AP 后立即灌胶。 2 灌凝胶时不能有气泡，以免影响电泳时电流的通过。 3 电泳时，电泳仪与电泳槽间正、负极不能接错，以免样品反方向泳动，电泳时应选用合适的电流、电压，过高或者过低都会影响电泳效果。 4 电泳时，为保证电泳结果满意，最好使用新稀释的缓冲液。 5 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺均为神经毒剂，对皮肤有刺激作用，操作时宜带手套，纯化应在通风柜中进行。 【思考题】 1 聚丙烯酰胺凝胶作为电泳支持物，有何优缺点？ 2 哪些因素可以影响凝胶的聚合？ 3 为什么在样品中加含有少许溴酚蓝的 40 蔗糖溶液？蔗糖及溴酚蓝各有何用途？ 附： 1 不同浓度 聚丙烯酰胺 凝胶的配制，见表 3 -2 。 表 3-2 不同浓度 聚丙烯酰胺 凝胶的配制 分离胶浓度 试剂名称 配制 30ml 不同浓度分离胶液所需试剂量（ ml ） 配制 10ml 3% 浓缩胶 7% 10% 12% 15% 20% 分离胶 储备液 缓冲液 7 7.5 10 7.5 12 7.5 15 7.5 20 7.5 浓缩胶 储备液 缓冲液 - - - - - - - - - - 1.0 1.25 1%TEMED 蒸馏水 2 13.3 2 10.3 2 8.3 2 5.3 2 0.3 2 5.65 以上各液加入后，为了去除抑制凝胶聚合的氧，在加入 Ap 之前应进行抽气处理。 10% 过硫酸胺 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.1 2 几种染料的性能及染色原理 （ 1 ）氨基黑 10B(amino black 10B) C 22 H 13 O 12 N 6 S 3 Na 3 ， MW=715,max=620 630mm 。氨基黑是酸性染料，其磺酸基与蛋白质反应构成复合盐。是最常用的蛋白质染料。缺点是灵敏度不太高，对 SDS 蛋白质染色效果不好，对不同的蛋白质着色度不同，色调不一（有蓝、黑、棕等）。 （ 2 ）考马斯亮蓝 R 250 (Comassie brilliant blue R 250 ) ： C 45 H 44 O 7 H 3 S 2 Na ， MW=824 ， max=560 590mm ，原理与氨基黑相似，灵敏度比氨基黑高 5 倍。尤其适用于 SDS 电泳微量蛋白质染色。但蛋白质浓度超出一定范围时，对高浓度蛋白质的染色不合乎 Beer 定律。 （ 3 ）考马斯亮蓝 G 250 ： 比考马斯亮蓝 R 250 多 2 个甲基， MW=854 ， max=590 610mm 。染色的灵敏度不如 R 250 ，但比氨基黑高 3 倍，优点在于它在三氯乙酸中不溶解成胶体，能选择地染蛋白质而几乎无本底色。所以常用于需重复性染色和稳定性的染色，适于定量分析。 聚丙烯酰胺不连续盘状电泳和垂直板电泳基本原理是相同的。后者适用于需要对比性分析的样品的电泳分析。这项电泳技术（ PAGE ）由于能够使样品区带浓缩变窄，所以分辨力高、设备简单、样品量小（ 1 100g ）；时间短，操作方便，可分离生物大分子的分子大小范围广泛，可结合 SDS 后进行亚基分析和分子量测定。这种方法目前几乎代替了超速离心沉降法。 PAGE 的用途较广，对生物大分子能进行分离、定性、定量分析，又能用于制备 mg 水平的材料 。 3 蛋白质染色方法（表 3-3 ） 表 3-3 蛋白质染色方法 方 法 固