[理学]02-蛋白质共价结构.ppt

生命化学基础 第二章 蛋白质的共价结构 2 一、蛋白质通论 w 蛋白质 ： w 核酸： 蛋白质和核酸构成了细 胞内原生质的主要成分 ，而原生质是生命现象 的物质基础 结构、功能、分离纯化、酶 信息物质 w 糖： 能源物质 w 脂： 生物膜成分 w 氨基酸：蛋白质的基础 激素、维生素、辅酶 3 （一）蛋白质的分类 传统分类法 蛋白质 单纯蛋白质:只由氨基酸组成 缀合蛋白质 氨基酸 辅助成分 4 （一）蛋白质的分类 1、清蛋白(albumin)：溶于水及稀盐、稀酸或稀碱溶液。为饱和硫酸 铵沉淀。广泛存在于生物体内，如血清清蛋白、乳清蛋白 2、球蛋白(globulin)：为半饱和硫酸铵沉淀，不溶于水而溶于稀盐 溶液的称优球蛋白(euglobulin)；溶于水的称假球蛋白(pseu doglobulin)。普遍存在于生物体内，如血清球蛋白、肌球蛋 白和植物种子球蛋白等。 3、谷蛋白(glutelin)：不溶于水、醇及中性盐溶液，但易溶于稀酸或 稀碱。如米谷蛋白和麦谷蛋白。 4、谷醇溶蛋白(prolamine)：不溶于水及无水乙醇，但溶于7080 乙醇中。脯氨酸和酰胺较多，非极性侧链较极性侧链多。主 要存在于植物种子中。如玉米醇溶蛋白、麦醇溶蛋白。 5、组蛋白(histone)：溶于水及稀酸，但为稀氨水所沉淀。分子中组氨 酸和赖氨酸较多，分子呈碱性。如小牛胸腺组蛋白等。 6、鱼精蛋白(protamine)：溶于水及稀酸，不溶于氨水。分子中碱性 氨基酸很多，分子呈碱性。如鲑精蛋白（salmin）。 7、硬蛋白(scleroprotein)：不溶于水、盐、稀酸及稀碱。是动物体内 作为结缔及保护功能的蛋白质。例如，角蛋白、胶原、网硬 蛋白和弹性蛋白。 单纯蛋白质的分类 5 （一）蛋白质的分类 1糖蛋白：含糖类。许多胞外基质蛋白质属糖蛋白，如纤连蛋白、 胶原蛋白和蛋白聚糖，球蛋白。 2脂蛋白：含三酰甘油、胆固醇、磷脂。如血浆脂蛋白，包括HDL (脂蛋白) 和LDL (脂蛋白) 等。 3核蛋白：辅基为核酸。如核糖体 (含RNA)，AIDS病毒 (含RNA) 和 腺病毒 (adenovirus，含DNA). 4磷蛋白：含与Ser、Thr和Tyr残基的羟基酯化的磷酸基。如酪蛋白 糖原磷酸化酶 a。 5金属蛋白：如铁蛋白 (ferritin) 含铁，乙醇脱氢酶含Zn，细胞色素 氧化酶含Cu和Fe，固氮酶含Mo和Fe ， 丙酮酸羧化酶含Mn。 6血红素蛋白：金属蛋白的亚类。辅基为血红素，是卟啉化合物，卟 啉中心含Fe。如血红蛋白、细胞色素c、过氧化氢酶 和硝酸盐还原酶。 7黄素蛋白(flavoprotein)：含黄素，辅基为FMN和FAD。如琥珀酸 脱氢酶(含FAD)、NADH脱氢酶(含FMN)、二氢乳清酸脱 氢酶(含FAD和FMN)和亚硫酸盐还原酶(含FAD和FMN) 缀合蛋白质的分类 6 （一）蛋白质的分类 蛋白质按生物学功能分类 1 酶(enzyme)：如核糖核酸酶、胰蛋白酶、果糖磷酸激酶、乙醇脱氢酶、 过氧化氢酶和苹果酸酶（malic enzyme） 2调节蛋白(regulatory protein)：如胰岛素、促生长素(GH)、促甲状腺素 (TSH)、乳糖阻抑物、核转录因子1(NF1)和分解代谢物激 活剂蛋白 3转运蛋白(transport protein)：如血红蛋白、血清清蛋白和葡糖转运蛋白 4储存蛋白(storage protein)：如卵清蛋白、酪蛋白、菜豆蛋白和铁蛋白 5收缩和游动蛋白(contractile and motile protein)：肌动蛋白、肌球蛋 白、微管蛋白、动力蛋白 (dynein) 和驱动蛋白 (kinesin) 6结构蛋白(structural protein)：如角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、 丝蛋白和蛋白聚糖 7支架蛋白(scaffold protein)：如胰岛素受体底物1、A激酶锚定蛋白和 信号传递转录激活剂 8保护和开发蛋白(protective and exploitive protein)：如免疫球蛋白、凝 血酶、血纤蛋白原、抗冻蛋白、蛇（蜂）毒蛋白、白喉毒 素和蓖麻毒蛋白 9异常蛋白(exotic protein)：如应乐果甜蛋白、节肢弹性蛋白和胶质蛋白 7 （一）蛋白质的分类 根据形状和溶解度分类 1.纤维状分子 (fibrous protein) 线性分子，有规则 ，细棒或纤维状 结构蛋白不溶于水 ；血纤蛋白原溶于 水 原胶原 胶原纤维 300nm，1.5nm 8 （一）蛋白质的分类 2. 球状分子(globular protein) 疏水链在球内，外部是亲水侧链 水溶性好，细胞内大部分水溶性蛋白 质是球蛋白 3. 膜蛋白 (membrane protein) 疏水侧链暴露于外部。 氨基酸组成：极性残基比球蛋白少 水不溶性蛋白 9 （二）化学组成和分子量 w 蛋白质的元素组成： C：50%，H：7%，O：23%，N：16%， S： 03%，其它 97%，已知相对分子量 Sanger法测序步骤 1、测定多肽链数目 确定N末端或C末端残基的摩尔数 末端残基的摩尔数 蛋白质摩尔数 1 多条肽链 1 单体，一条肽链 末端残基不相同时，表明蛋白质由不同肽链组成 32 变性剂： 8M 尿素，6M 盐酸胍 断裂二硫桥 2、建立测序参考点 鉴定末端残基，测定每条多肽链的氨基酸组成 3、降解多肽链 得到二套以上的肽段进行组成和末端残 基分析 4、氨基酸测序（Edman法、酶解法、质谱法） 5、构建完整肽链 6、确定二硫键位置 拆分亚基 33 (二)、N-末端和C-末端氨 基酸残基的鉴定 1、N末端分析 1）二硝基氟苯（DNFB 或 FDNB）法 Sanger反应 34 (二)、N-末端和C-末端氨 基酸残基的鉴定 2）丹磺酰氯（dansyl chloride， DNS）法 5dimethylamino naphthaline1 sulfonyl chloride 优点：灵敏度比DNFB法高100倍 35 3）苯异硫氰酸酯（PITC）法 Edman法 特点：能依次从肽的N端逐一切割氨基酸残基 4）氨肽酶法 亮氨酸氨肽酶，焦谷氨酸氨肽酶 特点：从肽链 N 端逐一降解氨基酸，适用于N 端的氨基酸残基被封闭的肽（如环肽） 36 (二)、N-末端和C-末端氨 基酸残基的鉴定 2、C末端分析 1）肼解法： Gln、Asn、Cys被破坏, Arg转变为鸟氨酸 37 2）还原法 还原，水解，用HPLC等方法分离鉴定 3）羧肽酶法 特点：从羧端逐一降解氨基酸 CPA：水解除 Pro、Arg、Lys 外的所有 C末端残基 CPB：只水解Arg、Lys为末端的肽链 CPY：所有氨基酸 38 (三)、二硫键断裂 39 (四)、氨基酸组成分析 酸水解方法：6 mol/L HCl, 110 特点：氨基酸不消旋 缺点：Trp完全破坏 Ser、Thr、Tyr部分破坏 Gln、Asn的酰氨基被水解 碱水解方法：5mol/L NaOH，110 特点：Trp可定量回收 缺点：大部分氨基酸被破坏 40 (四)、氨基酸组成分析 AA 残基 鸡溶菌 酶 牛乳 球蛋白 菠菜铁氧 还蛋白 烟草花叶病 毒外壳蛋白 马细胞 色素c 牛核糖 核酸酶 人碳酸 酐酶 蚕丝心 蛋白 Ala12159146121945 Val6971439179 Leu82181262202 Ile6104963101 Pro284844177 Met24002420 Phe342843114 Trp62131061 Gly123661231674 Ser1077160153017 Thr788161010142 Cys85512812 Tyr344446823 Asn135210510171 Gln39493790 Asp81111835144 Glu2169795134 Lys614421910185 Arg1131112473 His121034112 总数12916097158104124260206 41 (五)、多肽链的部分裂解 降解 分离 1、酶切法： 优点：专一性强，断裂点明 确，反应产率高 酶：蛋白水解酶（protease ） 常见蛋白酶： 胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶 ， 嗜热菌蛋白酶，胃蛋白酶等 在肽链内有固定的酶切位 点，也叫内切酶或内肽酶 （endopeptidase） 42 1) 胰蛋白酶(Trypsin) 特点：水解碱性氨基酸的COOH形成的肽键 马来酸酐可保护Lys 1,2 环己二酮能修饰Arg胍基 2）糜蛋白酶(Chymotrypsin) 水解COOH端为芳香族的氨基酸 也水解疏水氨基酸Leu、Met或His的 COOH端肽键 裂解能力受邻近氨基酸残基影响 碱性残基和酸性残基 44 3）嗜热菌蛋白酶（Thermolysin） 依赖Zn2和Ca2，可用来断裂较短的多肽链 4）胃蛋白酶（Pepsin） 要求芳香氨基酸和疏水氨基酸，断裂肽键 的二侧残基都是疏水氨基酸。最适pH2 5）木瓜蛋白酶（Papain） 对免疫球蛋白有特殊作用 6）葡萄球菌蛋白酶 (Staphylococcal protease) 磷酸缓冲液 (pH 7.8): Glu和Asp的COOH端肽键 碳酸氢铵缓冲液 (pH 7.8) 或醋酸缓冲液 (pH 4.0)： 只断裂Glu残基COOH端的肽键 45 (五)、多肽链的部分裂解 2、化学法 优点：专一性好，肽段大，适于自动化测序 溴化氰断裂法： CNBr 只断裂COOH端为Met的肽键，生 成肽酰高丝氨酸 47 (六)、肽段的氨基酸测序 第一步：偶联反应 条件：弱碱性，PITC只与未质子化的游离NH2反应 1、Edman化学测序法（1950） 苯氨基硫甲酰肽 48 (六)、肽段的氨基酸测序 第二步：环化断裂 第三步：转化反应 PTH氨基酸非常稳定，max = 268nm 49 (六)、肽段的氨基酸测序 优点：连续测定6070个残基 缺点：繁琐、工作量大 发展：DNSEdman降解，荧光标记PITC 2、酶降解法： 外切酶：氨肽酶和羧肽酶 限制：只能测定末端附近很少几个残基 3、质谱法： 电喷雾电离质谱(ESI)可进行小肽测序 5