《CR教程研究生用》PPT课件.ppt

一、DNA置备 6pg/细胞 （一）理想DNA样品的要求 1.纯度-RNA、蛋白质、多糖、脂类。 2.完整性-DNA大分子。 3.DNA量。 （二）经典DNA提取法 1.在弱碱和螯合剂的条件下行组织匀浆，溶 解胞、核膜。 2.去垢剂（SDS）与蛋白酶消化蛋白，分离 DNA。 3.有机溶剂（酚与氯仿）去除蛋白，萃取DNA 。 4.乙醇与盐类沉淀DNA。 （三）试剂的使用原理 1.弱碱和螯合剂：Tris-HCl pH8.0，DNA分子稳定。 EDTA（乙二胺四乙酸）-通过螯合镁离子抑制核酸 酶。 2.去垢剂与蛋白酶：SDS（十二烷基磺酸钠）增加膜 通透性；促进DNA与蛋白质分解；促使核酸酶与蛋 白质变性。 蛋白酶K酶解组蛋白。 3.有机溶剂：酚：变性沉淀蛋白质，组蛋白、蛋白 酶等。 氯仿：变性沉淀蛋白质，除酚，水相分离。 异戊醇：除酚，除泡沫。 4.乙醇与盐类：DNA不溶于乙醇与盐类。 （四）基本步骤 1.样品处理：分离细胞，低渗盐水（0.2%）或细胞悬浮液。 （10mmol/L Tris-HClpH8.0,0.1mol/LEDTA,20mg/ml胰RNA 酶,0.5%SDS）。 2.消 化：TNE缓冲液 （15mmol/L Tris- HClpH8.0,15mmol/LEDTA, 5mmol/L NaCl）4ml， 10%SDS0.45 ml，10mg/ml蛋白酶K（终浓度，100g/ml） ，混匀，503h，45过夜。 3.DNA 分离：等体积饱和酚；等体积饱和酚/氯仿/异戊醇（ 25/24/1）；氯仿/异戊醇（24/1）。500r/min,10min。 4.沉淀 DNA：1/10体积3mol/L NaAc，2倍无水乙醇-70%乙醇 。离心，挥干。可加醋酸钠（终浓度：0.3mol/L）并低温 。10-20分钟。 5.溶解DNA：适量TE（10mmol/L Tris- HClpH8.0,1mmol/LEDTA）,长时间。 （五）其他方法 1.Chelex-100提取DNA 基本成分：含有亚氨基二乙酸盐离子的苯乙烯-二乙基苯 共聚物。 基本方法：沉淀细胞；5%试剂200l；560.5h以上； 1008min；剧烈震荡；离心上清。注意：离心彻底。 2.硅珠法提取DNA 基本成分：GuSCN（硫氰酸胍，蛋白变性），二氧化硅（硅 珠，核酸吸附）。 基本方法：血液（1-4l）TES（100l）SDS（20l）煮 沸5min；300l GuSCN溶液与20l硅珠液保温15 min； 离心后加GuSCN溶液；离心加乙醇漂洗；TES5610 min离 心取上清。 3.直接煮沸法 10010min （六）注意事项 1.如消化不完全，可用TNE溶解后再重提。 2.消化时间宜长不宜短。 3.操作轻柔。 4.混匀要充分。 5.挥干不宜过度。 （七）DNA定量 1.凝胶电泳半定量分析法：参照标准分析。 2.分光光度计分析 基本原理：260nm波长为核酸吸收峰，1OD值为 50g/l双链核酸（40g/l单链核酸），根 据OD值可计算DNA含量。 计算方法：DNA浓度（g/l）=OD50稀释倍数1000 例：40倍稀释液，OD值为1.7 DNA浓度=1.750401000=3.4g/l 280nm波长为蛋白吸收峰，260/280比检测核酸纯 度。1.6-1.8 （八）DNA纯化 二、聚合酶链式反应技术 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）：在模板DNA和4种脱氧核 苷酸存在的条件下，由一对特异性引物限 定的靶DNA片段，经DNA聚合酶催化的体外 合成过程。100万倍，由数pg-数g。 （一）PCR的基本过程 1.变性（denaturation）:在加热的条件下（ 94左右），模板DNA配对碱基间氢键断裂，DNA 双链变成单链。 2.退火/复性（annealing）：在降温的条件 下（55-62），引物与其互补的模板DNA片段 （靶片段的側翼序列）结合形成杂交双链。 3.延伸（extension）：在合适的温度下（ 68-72），经DNA聚合酶催化4种脱氧核苷酸， 由引物的3端为起始点，从5向3端延伸，合成 新的与DNA 靶片段互补的DNA链。 每反应一个循环，靶DNA片段数量增加一倍，并 以指数的量堆积，经30余次循环，产物量可达到 2105-7个拷贝。几个循环后扩增产物作为模板 。 （二）PCR反应的体系 标准体系为50-100l，常用20l。 DNA模板10-50ng DNA聚合酶0.5-1.0U 一对引物0.1-0.5mol/L 4种脱氧核苷酸40mol/L 缓冲液 反应条件：954-5min,9450s/55- 6230-60s/7230-60s,30各循环后725 -10min。 （三）试剂的要求 1.引物：人工合成的单链DNA。 A：长度15-30bp，最好20-24 bp。 B：内部的互补序列。 C：引物间的互补序列。 D：序列的随机。 E：识别序列的单拷贝。 F：浓度：02-1mol/L。 G：应纯化低温保存。 2.DNA模板 A：量10-50ng左右。 B：纯，无污染。 3.DNA聚合酶 A：根据具体实验要求选择。60- 150/S,Taq DNA酶5-3外切酶活性。1/300 -18000错配。 B：注意外切酶活性，5-3或3-5。 C：活性最适温度70-75，半衰期一般 9540 min ；92130 min D：镁离子依赖。 E：低温保存。 （四）常见问题与处理 1.没有产物 （1）聚合酶活性，换酶。 （2）样品，换或重新处理。 （3）变性温度。 （4）检查引物，序列、二聚体等 2.非特异产物 （1）退火温度提高。 （2）降低镁离子浓度。 （3）调整引物、酶、样品加样量。 （4）减少循环次数。 （5）低温处理样品。 （6）换金牌酶。 （7）减少退火及延伸时间。 （8）巢式PCR或2重PCR。 3.产物量少 （1）降低退火温度。 （2）增加循环次数。 （3）增加样品量。 （4）适当增加镁离子浓度。 4.预防假阳性 样品、器械、操作防污染。 5.增强剂 可提高特异性与产量的方法: DMSO（5%）；甲酰胺（5%）；甘油（10% ）；牛血清白蛋白（20g/ml）等。 三、DNA多态性分析方法 （一）长度多态性分析 扩增片段长度多态性分析（amplified fragment length polymorphisms,Amp-RLP ）。主要指VNTR和STR。 步骤 1.PCR扩增 遗传标记特异性由特异性引物决定。 2.电泳分离PCR产物 A：凝胶：聚丙烯酰氨凝胶（polyacrylamide gel,PAG）， 成分：丙烯酰氨与甲叉丙烯酰氨 凝胶浓度（T）：6-8%，与分析的片段大小有关。 交联度（C）：3%，甲叉/丙烯酰氨与甲叉 B:载样缓冲液：甘油（蔗糖）密度重力，防扩散。 泳速指示剂：溴酚蓝（5%，65bp） 二甲苯青（5%，260bp） C：电压：100-200V 3.谱带显示 A：溴化乙啶（ethidium bromide,EB）染色： 嵌合于DNA双链间，紫外线激发红色荧光。 注意：强致变剂,可加凝胶中或凝胶放染色液 中染色。 B：银染色：AgNO3，Ag+可与DNA稳定结合，甲 醛还原Ag+颗粒，显黑褐色。比溴乙啶敏感度高。 C：荧光显色：（P78）染料标记在引物5端， 激光激发。 4.基因型判定 根据等位基因分型标准物（allele ladder） 或片段长度标准物(molecular marker)同步电泳 比对判型。 注意事项：出现3条谱带或3个峰时，污染；混 合样品；变异 （二）序列多态性分析 1.限制性片段长度多态性分析法 限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphisms,RFLPs） 因DNA核苷酸序列的变异，使DNA限制性内 切酶识别部位产生或消失，致使酶切片段 长度和/或数量发生变化而呈现的DNA多态 性。 （1）限制性片段长度多态性的DNA基础 A：识别部位的点突变：碱基的替换、修 饰（甲基化）或插入与缺失。 B：识别部位间的片段插入与缺失。 C：识别部位间的重复序列数目的变化。 （2）DNA限制性内切酶（ restriction endonuclease）能够识别特定的DNA序列，并在特 定部位将DNA双链切断的酶。 A：生物学功能：水解核酸的磷酸二酯键。 B：命名：根据微生物的种（第一个字母大写 ）、属（前二个字母小写）、变种（第一个字母 大写）、发现分离的顺序（罗马数字）。 C：分类：型：远离识别部位随机切割，非 特异。 型：在识别部位内部特定点切割 ，特异。 型：在识别部位后特定点切割， 特异。 D：单位：1U：在标准条件下，1h完全水解 1g噬菌体的酶量。 型DNA限制性内切酶 A：识别核酸序列数目4-6个。 B：识别序列为回纹序列。 C：切割后产生的末端分为粘行末端与平末端。 例：Pst 5-CTGCAG-3 3-GACGTC-5 Hae 5-GGCC-3 3-CCGG-5 （3）分型法：酶+缓冲液+样品在一定的温度下孵 育后电泳检测。 （4）注意事项：A：星号活力。 B：消化时间宜长不宜短。 C：阳性可肯定，阴性要慎重。 2.等位基因特异性寡核苷酸探针杂交分析法 等位基因特异性寡核苷酸探针（allele specific oligonucleotide,ASO）：根据硷基互 补的原则,制备识别特定寡核苷酸序列的单链DNA 探针,并标记示踪物,在高强度条件下与变性DNA样 品杂交,检测示踪物,阳性者为检出相应的等位基 因。 相关概念: A：杂交：两条异源寡核苷酸单链按照硷基互补的 原则复性为双链的过程。 B：探针：标记有示踪物，能够识别靶核苷酸序列 并与之复性杂交的具有已知序列的寡核苷酸单链 。 （2）探针的条件 A：长度为10-20bp左右。 B：具备高度特异性。 C：容易标记示踪物。 D：在杂交过程中本身性质稳定。 （3）对示踪物的要求 A：高灵敏度。 B：不影响探针的特异性。 C: 不影响探针的杂交特性。 D：不改变本身的特性。 E：检测方法特异。 F：安全可靠无公害。 G：检测方法简单，重复性好。 （4）示踪物的种类 A：放射性同位素-灵敏度高，有放射性污染。 B：非放射性物质：半抗原 生物素 荧光物质 酶：辣根过氧化物酶 碱性磷酸酶 （5）检测方法 斑点印迹杂交dot blot hybridization 反向斑点杂交reverse dot blot hybridization （6）基本操作过程 A：固相滤膜印迹 打点；Southern转移；真空 转移；电转移。常用尼龙膜。 B：DNA变性 碱变性；紫外线照射；真空烘烤 。 C；预杂交 封闭（蛋白质或其他生物DNA） D；杂交 高强度杂交：温度高，离子强度低。 特异不利于复性。 低强度杂交：温度低，离子强度高。 利于复性，特异性差。 E：漂洗 F：示踪物显示。 3.等位基因特异性PCR（序列特异性引物PCR） 等位基因特异性PCR （allele specific PCR， ASPCR） 序列特异性引物PCR（sequence specific primers,SSP-PCR）。 基本原理：根据待测等位基因的碱基差异设计3 条特异性引物，其中2条引物为上游（或下游）引 物，其3端第1个碱基（或第2、3个碱基）分别与 等位基因特异性碱基互补，作为等位基因特异性 引物；1条下游（或上游）引物作为共通引物。分 为两个体系同时PCR扩增，对比电泳，依据PCR产 物的有无判定等位基因的型别，有PCR产物者为阳 性，证实该等位基因存在。 变法 A：同步扩增：设计3条引物，2条等位基因特异性引 物，其5端长度有差异（5端差4-6bp），与共通引物引 物在1个体系中同时PCR扩增，电泳后，依据PCR产物片段 的有无与谱带的位置判定等位基因的型别。 B：同一片段多等位基因同时检测：依据片段上等位 基因数目，设计两组多条等位基因特异性引物，分别与共 通引物在1个体系中同时PCR扩增，对比电泳后，依据PCR 产物片段的有无与谱带的位置判定等位基因的型别。 C：不同染色体上多等位基因同时检测：设计两组多 条等位基因特异性引物及相应的共通引物，并在引物的5 端人工设计10bp左右碱基序列，PCR产物对比电泳后，依 据PCR产物片段的有无与谱带的位置判定等位基因的型别 。 D:双向等位基因特异性PCR（bidirectional PCR amplification of specific alleles，BiPASA） 技术关键点：1.引物特异性碱基设计的位置。 2.多位点复合扩增的PCR反应条件。 双向等位基因特异性PCR 4.PCR单链构型多态性分析 PCR单链构型多态性（PCR-single strand conformation polymorphism,PCR- SSCP）：PCR产物热变性后形成单链DNA， 在非变性凝胶中，因DNA片段碱基排列顺序 的不同，单链DNA形成不同的（空间构型， 导致电泳迁移率的差别而呈现多态性，根 据谱带的位置判定型别。 特点： A：样品需要充分变性（加样品缓冲液 ，沸水浴10min），并保持至电泳前。 B：电泳凝胶为非变性凝胶。 C：泳动过程中温度保持恒定。 D：分辨率高，可检测出单一碱基变异 ，检出率90%以上。 E：重复性稍差，多用于筛选实验。 F：不能确定突变碱基的种类与位置。 G：样品片段应短于500bp。 H：电泳谱型可能出现2-4条谱带,纯合 子2条,杂合子4条。有例外. 连接滚环扩增反应（ligation-rolling circle amplication，L-RCA） 6.DNA序列分析（双脱氧核苷酸末端终止法） 基本原理：在常规PCR反应体系中加入 四种2，3-双脱氧单核苷酸，由1条引物进 行PCR反应，在正常的模板DNA复制同时， 当有2，3-双脱氧单核苷酸结合到产物3端 后，下一个单核苷酸不能够与之形成磷酸 二酯键，使DNA片段延伸终止于该2，3-双 脱氧单核苷酸处，根据不同长度含有2，3- 双脱氧单核苷酸片段的检测结果判定PCR产 物的单核苷酸序列。 特点： A：完全忠实地反映靶片段核苷酸排列顺 序。 B：测序反应为1条引物（浓度低于常规 PCR反应）。 C：根据方法学，一次反应可测200-500 bp。 D：产物分析分别有手工与机器自动化方 法。 测序乱码的问题与解决方法 原因：样品不纯。 解决方法： A：调整PCR条件； B：巢式PCR，全巢式PCR或半巢式PCR； C：取谱带二次PCR； D：设计内侧引物测序； E：克隆测序； 四、电泳检测技术 （一）电泳的基本原理 带电粒子在电场中向其与自身带相反电 荷的电极移动。 带电性质决定泳动方向； 带电量决定泳动速度。 蛋白质-两性电解质：COO-与NH3+ 在酸性环境下-COO+H-带正电-向负极 泳动 在碱性环境下COO-带负电-向正极泳动 核苷酸-两性电解质 在pH3.5时，氨基解离，仅第一个磷酸解 离，带正电-向负极泳动， 在pH8.0-8.3，氨基不解离，磷酸全部解 离，带负电-向正极泳动， （二）影响迁移率的因素 1.样品的物理性状 Q U= 6V U：迁移率，V：泳动速度，Q：颗粒带电 荷量，：颗粒半经，：介质粘度。 2.电场强度 一般为5V/cm 3.溶液的pH值 决定了带电粒子解离的程度，即携带净 电荷的量。 4.溶液的离子强度 离子强度高泳动慢。 TAE（Trsi-醋酸）；TBE（Trsi-硼酸）； TPE（Trsi-磷酸） TAE缓冲能力弱；TPE易生成磷酸盐沉淀 DNA；TBE较好。 5.支持介质的性质-凝胶孔经大小。 （三）核酸电泳的指示剂与染色剂 1.核酸电泳的指示剂 溴酚蓝（Bh）蓝紫色； 二甲苯青（Xc）蓝色。 2.核酸电泳的染色剂 A：溴乙锭染色法 溴乙锭（ethidium bromide,EB），属于 荧光染料，嵌入配对碱基间，接受300nm和 360nm的紫外线，发出590nm红色荧光。敏 感度约10n