《CR原理及应用》PPT课件.ppt

聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)，是一项在短时间内大量扩 增特定的片段的分子生物学技术。 PCR又称为无细胞克隆系统或特异性DNA序 列体外引物定向酶促扩增法，它可将极微量 的靶DNA在数小时内特异地扩增上百万倍。 70年代初，Kleppe等人就提出了PCR的工作原 理。Saiki（1985）和Mullis（1986）两家研究室分 别用改进的Kleppe法获得了大量染色体DNA单拷贝 基因。当时的PCR技术须在每次变性和退火后，扩 增反应前重新加入DNA聚合酶。 1988年，由于在PCR系统引入了热稳定的Taq DNA聚合酶，这是从水生栖热菌（Thermus aquaticus）中提取的耐热DNA聚合酶。多次循环 后的Taq DNA聚合酶仍然具有活性，因此反应体 系自动往复多次地进行对所需的DNA的片段的酶 促合成，使反应产物按指数增长，所以命名为聚 合酶链式反应。 PCR基本原理 PCR是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法.它包括 三个基本步骤: (1) 变性(Denaturation):目的双链DNA片段在 94下解链; (2) 退火(Annealing):两种寡核苷酸引物在适当 温度(50左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3) 延伸(Extension): DNA模板引物结合物在Taq DNA聚合 酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱 基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链 互补的链。 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增 量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用C C C C 0 0 (1+P) (1+P) n n 计算。 C代表DNA片段扩增后的拷 贝数， C C 0 0 表示扩增开始时DNA模板数，P表示 平均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩 增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均 效率达不到理论值。 PCR的反应动力学 反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指 数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增 的DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性 增长期或静止期， 即出现“停滞效应” 这种 效应称平台期，平台期受PCR 扩增效率、 DNA聚合酶的种类和活性及非特异性产物 的竞争等因素的影响。 PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段 两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个 引物链5端之间，是需要扩增的特定片段。短 产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模 板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在 第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板， 引物是从3端开始延伸， 其5端是固定的，3 端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长 产物片段”。 PCR扩增产物 进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同 新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结时， 由于新链模板的5端序列是固定的， 这就等于这次延伸的 片段3端被固定了止点， 保证了新片段的起点和止点都限 定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。 不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加， 而“长产物片 段”则以算术倍数增加， 几乎可以忽略不计， 这使得PCR 的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分 析与检测用。 PCR反应的特点 n引物与模板DNA特异正确的结合 n碱基配对原则 nTaq DNA聚合酶合成反应的忠实性 n靶基因的特异性与保守性。 灵敏度高PCR反应特点 PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克 (pg=10- 12)量级的起始待测模板扩增到微克(g=10-6) 水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病 毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个PFU(空斑形成 单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。 PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加 好后，即在DNA扩增仪上进行变性-退火-延伸反应，一般在2 4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析。 PCR反应特点简单、快速 不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制 品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床 标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、 活组织等粗制的DNA扩增检测。 PCR反应特点对标本的纯度要求低 PCR反应体系优化 PCR反应体系 引物 dNTP Mg2+ Taq聚合酶 模板 反应缓冲液 引物设计的3条基本原则： 引物与模板的序列要紧密互补 引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构 ， 引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即 错配)。 PCR反应体系引物 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于 38bp，因为过长会导致其延伸温度大于74，不适于Taq DNA聚 合酶进行反应。 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3端相似性较高的 序列，否则容易导致错配。引物3端出现3个以上的连续碱基，如 GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。 引物3端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同 的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配 效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3端使用碱基A 。另外，两条引物3端若互补，或者单条引物自身形成发夹结构也 可能导致PCR反应失败。 PCR反应体系引物设计注意事项 5端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。 可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、 缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等. 通常应 在5端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。 简并引物应选用简并程度低的密码子, 例如选用只有一种密码子的 Met, 3端应不存在简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增产 物。 两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应 ，因为GC含量决定了DNA双链的解链温度（Tm）。另外，上下游引物 的GC含量不能相差太大。 PCR反应体系引物设计注意事项 引物所对应模板位置序列的Tm值在72左右可使复性条件最佳。Tm 值的计算有多种方法，如按公式Tm4(G+C)2(A+T)，在Oligo软 件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method) 。 G值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱 基对的相对稳定性。应当选用3端G值较低（绝对值不超过9），而5 端和中间G值相对较高的引物。引物的3端的G值过高，容易在错 配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引 物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。 对引物的修饰一般是在5端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插 入PCR产物的载体的相应序列而确定。 PCR反应体系引物设计注意事项 一般PCR反应中的引物终浓度为0.2-1.0mol/L。引物过多会 产生错误引导或产生引物二聚体, 过低则降低产量。利用紫外 分光光度计, 可精确计算引物浓度, 在1cm光程比色杯中 ,260nm下,引物浓度可按下式计算： X mol/L OD260/ A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600) X: 引物摩尔浓度, A、C、G、T: 引物中4种不同碱基个数。 引物浓度计算PCR反应体系 dNTPdNTP原液可配成原液可配成5-10mmol/L5-10mmol/L并分装并分装,-20,-20贮存。一般反贮存。一般反 应中每种应中每种dNTPdNTP的终浓度为的终浓度为20-200mol/L20-200mol/L。理论上理论上4 4 种种 dNTPdNTP各各20mol/L,20mol/L,足以在足以在100l100l反应中合成反应中合成2.6g2.6g的的DNADNA 。当。当dNTPdNTP终浓度大于终浓度大于50mmol/L50mmol/L时可抑制时可抑制TaqTaq DNA DNA聚合聚合 酶的活性；酶的活性；4 4种种dNTPdNTP的浓度应该相等的浓度应该相等, ,以减少合成中由于以减少合成中由于 某种某种dNTPdNTP的不足出现的错误掺入。的不足出现的错误掺入。 PCR反应体系 4 4种三磷酸脱氧核苷酸种三磷酸脱氧核苷酸 ( (dNTPdNTP) ) MgMg2+ 2+浓度对 浓度对TaqTaq DNA DNA聚合酶影响很大聚合酶影响很大, ,它可影响酶的活性和 它可影响酶的活性和 真实性真实性, ,影响引物退火和解链温度影响引物退火和解链温度, , 影响产物的特异性以及引影响产物的特异性以及引 物二聚体的形成等。通常物二聚体的形成等。通常MgMg2+ 2+ 浓度范围为 浓度范围为0.5-2mmol/L0.5-2mmol/L。对对 于一种新的于一种新的PCRPCR反应反应, ,可以用可以用0.1-5mmol/L0.1-5mmol/L的递增浓度的的递增浓度的MgMg2+ 2+ 进行预备实验进行预备实验, ,选出最适的选出最适的MgMg2+ 2+浓度。在 浓度。在PCRPCR反应混合物中反应混合物中, , 应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团, , 例如磷酸基团或例如磷酸基团或 EDTAEDTA等可能影响等可能影响MgMg2+ 2+ 离子浓度的物质 离子浓度的物质, ,以保证最适以保证最适MgMg2+ 2+ 浓 浓 度。度。 PCR反应体系 Mg Mg2+ 2+ 就模板就模板DNADNA而言而言, ,影响影响PCRPCR的主要因素是模板的数量的主要因素是模板的数量 和纯度和纯度. .一般反应中的模板数量为一般反应中的模板数量为1010 2 2 -10 -10 5 5 个拷贝个拷贝, ,对于单对于单 拷贝基因拷贝基因, ,这需要这需要0.1g0.1g的人基因组的人基因组DNA,10ngDNA,10ng的酵母的酵母 DNA,1ngDNA,1ng的大肠杆菌的大肠杆菌DNADNA；扩增多拷贝序列时；扩增多拷贝序列时, ,用量更用量更 少；灵敏的少；灵敏的PCRPCR可从一个细胞可从一个细胞, ,一根头发一根头发, ,一个孢子或一一个孢子或一 个精子提取的个精子提取的DNADNA中分析目的序列；模板量过多则可能中分析目的序列；模板量过多则可能 增加非特异性产物增加非特异性产物.DNA.DNA中的杂质也会影响中的杂质也会影响PCRPCR的效率的效率 。 PCR反应体系模板 模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键 环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和 蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是： 溶 解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而 破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能 与蛋白质结合而沉淀； 蛋白酶K能水解消化蛋白 质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂 酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇 或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用 于PCR反应。 PCR反应体系模板的提取方法 TaqTaq DNA DNA聚合酶活性半衰期为聚合酶活性半衰期为92.592.5 130min,95 130min,95 40min, 40min, 9797 5min. 5min.现在人们又发现许多新的耐热的现在人们又发现许多新的耐热的DNADNA聚合酶聚合酶, ,这这 些酶的活性在高温下活性可维持更长时间些酶的活性在高温下活性可维持更长时间. .TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶 的酶活性单位定义为的酶活性单位定义为7474下下,30min,30min,掺入掺入10nmol/L 10nmol/L dNTPdNTP到到 核酸中所需的酶量核酸中所需的酶量. . PCR反应体系TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶 n n TaqTaq DNA DNA聚合酶的一个致命弱点是它的出错率聚合酶的一个致命弱点是它的出错率, , 一般一般PCRPCR中出错率为中出错率为210210-4 -4 核苷酸 核苷酸/ /每轮循环每轮循环, , 在利用在利用PCRPCR克隆和进行序列分析时尤应注意克隆和进行序列分析时尤应注意. .在在 100l PCR100l PCR反应中反应中,1.5-2,1.5-2单位的单位的TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶 就足以进行就足以进行3030轮循环轮循环. .所用的酶量可根据所用的酶量可根据DNADNA、 引物及其它因素的变化进行适当的增减引物及其它因素的变化进行适当的增减. .酶量过酶量过 多会使产物非特异性增加多会使产物非特异性增加, ,过少则使产量降低过少则使产量降低. . 反应结束后反应结束后, ,如果需要利用这些产物进行下一步如果需要利用这些产物进行下一步 实验实验, ,需要预先灭活需要预先灭活TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶, , 灭活灭活TaqTaq DNADNA聚合酶的方法有：聚合酶的方法有： (1) PCR(1) PCR产物经酚产物经酚: :氯仿抽提氯仿抽提, ,乙醇沉淀。乙醇沉淀。 (2) (2) 加入加入10mmol/L10mmol/L的的EDTAEDTA螯合螯合Mg2+ Mg2+ 。 (3) 99-100(3) 99-100加热加热10min.10min. 目前已有直接纯化目前已有直接纯化PCRPCR产物的产物的KitKit可用。可用。 PCR反应体系 TaqTaq DNA DNA聚合酶灭活方法聚合酶灭活方法 缓冲液一般含缓冲液一般含10-50mmol/L 10-50mmol/L TrisClTrisCl (20 (20下下pH8.3-8.8), pH8.3-8.8), 50mmol/L 50mmol/L KClKCl和适当浓度的和适当浓度的MgMg2+ 2+ . . TrisClTrisCl在在2020时时pHpH为为 8.3-8.8,8.3-8.8,但在实际但在实际PCRPCR反应中反应中,pH,pH为为6.8-7.8. 50mmol/L6.8-7.8. 50mmol/L的的 KClKCl有利于引物的退火有利于引物的退火. .另外另外, ,反应液可加入反应液可加入5mmol/L5mmol/L的二硫的二硫 苏糖醇苏糖醇(DDT)(DDT)或或100g/ml100g/ml的牛血清白蛋白的牛血清白蛋白(BSA),(BSA),它们可稳它们可稳 定酶活性定酶活性, ,另外加入另外加入T4T4噬菌体的基因噬菌体的基因3232蛋白则对扩增较长蛋白则对扩增较长 的的DNADNA片段有利片段有利. .各种各种TaqTaq DNA DNA聚合酶商品都有自己特定聚合酶商品都有自己特定 的一些缓冲液。的一些缓冲液。 PCR反应体系 PCR PCR反应缓冲液反应缓冲液 PCRPCR反应参数反应参数 在第一轮循环前在第一轮循环前, ,在在9494下变性下变性5-10min5-10min非常重要非常重要, ,它可它可 使模板使模板DNADNA完全解链完全解链, ,然后加入然后加入TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶(hot (hot start),start),这样可减少聚合酶在低温下仍有活性从而延伸非这样可减少聚合酶在低温下仍有活性从而延伸非 特异性配对的引物与模板复合物所造成的错误。变性不特异性配对的引物与模板复合物所造成的错误。变性不 完全完全, ,往往使往往使PCRPCR失败失败, ,因为未变性完全的因为未变性完全的 DNADNA双链会很双链会很 快复性快复性, ,减少减少DNADNA产量。产量。 对于富含对于富含GCGC的序列的序列, ,可适当提高变性温度可适当提高变性温度. .但变性温度但变性温度 过高或时间过长都会导致酶活性的损失。过高或时间过长都会导致酶活性的损失。 变变 性性 引物退火的温度和所需时间的长短取决于引物的碱基组成，引物退火的温度和所需时间的长短取决于引物的碱基组成， 引物的长度、引物与模板的配对程度以及引物的浓度引物的长度、引物与模板的配对程度以及引物的浓度. .实际使实际使 用的退火温度比扩增引物的用的退火温度比扩增引物的TmTm值约低值约低5 5。一般当引物中。一般当引物中GCGC 含量高含量高, ,长度长并与模板完全配对时长度长并与模板完全配对时, , 应提高退火温度。退火温应提高退火温度。退火温 度越高度越高, , 所得产物的特异性越高。有些反应甚至可将退火与延所得产物的特异性越高。有些反应甚至可将退火与延 伸两步合并伸两步合并, ,只用两种温度只用两种温度( (例如用例如用6060和和9494) )完成整个扩增完成整个扩增 循环循环, , 既省时间又提高了特异性。既省时间又提高了特异性。 退退 火火 延伸反应通常为延伸反应通常为7272, ,接近于接近于TaqTaq DNA DNA聚合酶的最适反应温聚合酶的最适反应温 度度7575. .实际上实际上, ,引物延伸在退火时即已开始引物延伸在退火时即已开始, ,因为因为TaqTaq DNA DNA聚聚 合酶的作用温度范围可从合酶的作用温度范围可从2020-85-85. .延伸反应时间的长短取延伸反应时间的长短取 决于目的序列的长度和浓度决于目的序列的长度和浓度. .在一般反应体系中在一般反应体系中, ,TaqTaq DNA DNA聚聚 合酶每分钟约可合成合酶每分钟约可合成2kb2kb长的长的DNADNA。延伸时间过长会导致产延伸时间过长会导致产 物非特异性增加物非特异性增加. .但对很低浓度的目的序列但对很低浓度的目的序列, , 则可适当增加延则可适当增加延 伸反应的时间。一般在扩增反应完成后伸反应的时间。一般在扩增反应完成后, ,都需要一步较长时都需要一步较长时 间间(10-30min)(10-30min)的延伸反应的延伸反应, ,以获得尽可能完整的产物以获得尽可能完整的产物, , 这对以这对以 后进行克隆或测序反应尤为重要。后进行克隆或测序反应尤为重要。 延延 伸伸 当其它参数确定之后当其它参数确定之后, , 循环次数主要取决于循环次数主要取决于DNADNA浓度。一浓度。一 般而言般而言25-3025-30轮循环已经足够。循环次数过多轮循环已经足够。循环次数过多, ,会使会使PCRPCR产产 物中非特异性产物大量增加。通常经物中非特异性产物大量增加。通常经25-3025-30轮循环扩增后轮循环扩增后, , 反应中反应中TaqTaq DNA DNA聚合酶已经不足聚合酶已经不足, , 如果此时产物量仍不够如果此时产物量仍不够, , 需要进一步扩增需要进一步扩增, , 可将扩增的可将扩增的DNADNA样品稀释样品稀释1010 3 3 -10-10 5 5 倍作为倍作为 模板模板, , 重新加入各种反应底物进行扩增重新加入各种反应底物进行扩增, , 这样经这样经6060轮循环轮循环 后后, , 扩增水平可达扩增水平可达1010 9 9 -10-1010 10 。 。 循环次数循环次数 扩增产物的量可用下列公式表示扩增产物的量可用下列公式表示:C:CC0 (1+P)C0 (1+P) n n 。其中：其中：C C为为 扩增产物量扩增产物量,C0 ,C0 为起始为起始DNADNA量量, P, P为扩增效率为扩增效率, n, n为循环次数。为循环次数。 在扩增后期 在扩增后期, ,由于产物积累由于产物积累, ,使原来呈指数扩增的反应变成使原来呈指数扩增的反应变成 平坦的曲线平坦的曲线, ,产物不再随循环数而明显上升产物不再随循环数而明显上升, ,这称为平台效应。这称为平台效应。 平台期会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大平台期会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大 量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台 期前结束反应，期前结束反应， 减少非特异性产物。减少非特异性产物。 扩增效率 PCR扩增产物的分析 n凝胶电泳分析 (1) 琼脂糖凝胶电泳： 通常应用12%的琼脂糖 凝 胶， 供检测用。 (2) 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：610%聚 丙烯酰胺凝胶 电泳分离效果较琼脂糖好 n酶切分析 n分子杂交 n测序 功能 引物设计 限制性内切酶位点分析 DNA基序(motif)查找 同源性分析 常规PCR技术及几类PCR新技术 q热启动PCR qTouch-down PCR qRT-PCR q简并引物PCR q巢氏PCR q反向PCR q不对称PCR q原位PCR q连接酶链反应 qRACE-PCR qAFLP q免疫PCR(immuno-PCR) 热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性 最重要的方法之一。尽管Taq DNA聚合酶的最佳延伸温度 在72，聚合酶在室温仍然有活性。因此，在进行PCR反 应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火 温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形 成，就会被有效扩增。在用于引物设计的位点因为遗传元 件的定位而受限时，如site-directed突变、表达克隆或用于 DNA工程的遗传元件的构建和操作，热启动PCR尤为有效 。 限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配 制PCR反应液，并将其置于预热的PCR仪。这种方法简单 便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除 非特异性产物的扩增。 热启动PCR 热启动通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪达到变性温度。 包括延缓加入Taq DNA聚合酶在内的大部分手工热启动方法十分烦琐，尤其 是对高通量应用。其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本成分，如镁离子 或酶，包裹起来，或者将反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开。在热循 环时，因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。象手动热启动方法一样 ，蜡防护层法比较烦琐，易于污染，不适用于于高通量应用。 Platinum DNA聚合酶对于自动热启动PCR来说方便高效。Platinum Taq DNA聚合酶的成分为复合有抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体的重组Taq DNA聚 合酶。此酶在常温下活性被封闭，要在94 95下加热数分钟才能够恢复 酶活性。同经化学修饰用于热启动的Taq DNA聚合酶相比，Platinum酶不需 要在94延时保温（10到15分钟）以激活聚合酶。使用PlatinumTaq DNA聚 合酶，在94进行2分钟就可以恢复90的Taq DNA聚合酶活性。 热启动PCR Touch-down PCR又称降落PCR。即选选定一个温度范 围围，如5035 ，每降1-2 进进行1-2个循环环，然后在 50度下进行15个循环环。 Touch-down的原理：随着退火温度的降低，特异性逐 步降低，但特异性条带带在温度较较高时时已经扩经扩 增出来，其浓浓 度远远远远 超过过非特异性条带带，随着退火温度的降低，特异性 条带优带优 先被扩扩增。 选择初始复性温度的原则：起始复性温度应该比引物的 Tm值高出5-10度，然后每个循环递减1-2度 Touch-down PCR low copy of targeted DNA; high degree degeneracy (or less specific) of the first set of primers; RT-PCR using oligo-dT. Touch-down PCR的应用范围 RT-PCR RNA的多聚酶反应（RT-PCR）是以RNA 为模板，联合逆 转录反应 （reverse transcription，RT）与PCR，可用于检测单个细 胞或少数 细胞中少于10个拷贝的RNA模板。 RNA扩增包括两个步骤： 在单引物的介导下和逆转录酶的催化下，合成RNA的互补 cDNA 加热后cDNA与RNA链解离，然后与另一引物退火，并由 DNA聚 合酶催化引物延伸生成双链靶DNA， 最后扩增靶DNA Double strand cDNA AAAAA TTTTT RT AAAAA TTTTT RT RT AAAAA TTTTT Oligo dT primer is bound to mRNA Reverse transcriptase (RT) copies first cDNA strand Reverse transcriptase digests and displaces mRNA and copies second strand of cDNA RT-PCR A. Double strand DNA B. Denature 96 50 C. Anneal primers 50 D. Polymerase binds 72 Taq Taq RT-PCR cDNA第二链的合成方法有以下几种: (1) 自身引导法 合成的单链cDNA 3 端能够形成一短的 发夹结构,这就为第二链的合成提供了现成的引物,当第一链合 成反应产物的DNA:RNA杂交链变性后利用大肠杆菌DNA聚合酶 Klenow片段或反转录酶合成cDNA第二链,最后用对单链特异性 的S1核酸酶消化该环,即可进一步克隆。但自身引导合成法较 难控制反应，而且用S1核酸酶切割发夹结构时无一例外地将导 致对应于mRNA 5端序列出现缺失和重排,因而该方法目前很 少使用。 (2) 置换合成法 该方法利用第一链在反转录酶作用下产 生的cDNA:mRNA杂交链不用碱变性,而是在dNTP存在下,利用RNA 酶H在杂交链的mRNA链上造成切口和缺口。从而产生一系列RNA 引物,使之成为合成第二链的引物,在大肠杆菌DNA聚合酶的 作用下合成第二链。该反应有3个主要优点: (1) 非常有效; (2) 直接利用第一链反应产物,无须进一步处理和纯化; (3) 不必使用S1核酸酶来切割双链cDNA中的单链发夹环。 RT-PCR RT-PCR优化条件 模板 ：作为模板的RNA分子必须是完整的，并且不含DNA、蛋白和其 他杂质。RNA中即使含有最微量的DNA，经扩增后也会出现非特异性 扩增；蛋白若未除干净，与RNA结合后会影响逆转录和PCR；残留的 RNase极易将模板RNA降解掉。 逆转录酶： 1)目前商品化反转录酶有从禽类成髓细胞瘤病毒纯化到的 禽类成髓细胞病毒(AMV)逆转录酶和从表达克隆化的 Moloney鼠白血病病毒反转录酶基因的大肠杆菌中分离到的 鼠白血病病毒(MLV)反转录酶。AMV反转录酶包括两个具有 若干种酶活性的多肽亚基,这些活性包括依赖于RNA的DNA合 成,依赖于DNA的 DNA合成以及对DNA:RNA杂交体的RNA部分 进行内切降解(RNA酶H活性)。MLV反转录酶只有单个多肽亚 基,兼备依赖于RNA和依赖于DNA的DNA合成活性,但降解 RNADNA杂交体中的RNA的能力较弱,且对热的稳定性较AMV反 转录酶差。 2)普通逆转录酶反应温度为37-42度，然而一些有丰富二级结构的 复杂模板或者高GC含量的模板在常温下扩增困难，需要将逆转录 反应置于较高温度下进行改善扩增。对于较高的反应温度，建议使 用cMASTER-RT酶，该酶在37-60度的温度范围内都能保持良好的 活性，使用cMASTER-RT酶，可以增加反应产量，还可以增加逆 转录反应的特异性。因为，对于使用基因特异性引物（GSP）进行 cDNA合成时，较高的反应温度允许使用Tm值较高的基因特异性引 物。 Taq酶 普通的Taq酶扩增能力很强但是错配率高，虽然高产但是最 大只能 扩增3-5kb的片段；而本身带有校读功能的高保真酶有很高的 保真度，不易出错，可扩增较长的片段，但是产量偏低。 TripleMaster酶则是一个高保真的混合酶在保留Taq酶的高聚合能 力，保证高产的同时，还有效降低了Taq的错配率，大大提高了保真 性。 RT-PCR buffer 引物：(1)上下游引物设计在跨内含子的两个外显子的3端和下一个 外显子的5端，这样不会在基因组上扩出来。(2)设计在两个离得远 的外显子上，这样从基因组和cDNA上得到的片段长度不一样，可以 一引两用。 Random 9mers 适用于长的及具有Hairpin构造的RNA。适用于 rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA的反转录反应 ( 用Random 9mers合成cDNA后，任何特异性的 Primer pair都可用于PCR反应)。 Oligo dT-Adaptor Primer适用于具有Poly(A)+ tail的RNA。 注: 原核生物的RNA、真核生物的rRNA及tRNA (某 些种类真核生物的mRNA)不具有Poly(A) tail。本 Primer设计巧妙，反转录效率高。反转录反应后， 用M13 Primer M4可进行3-RACE。 一步法： 利用同一缓冲液，在同一体系中加入逆转录酶、引物、 Taq酶、4种dNTP 直接进行mRNA反转录与PCR扩增。发现Taq酶 不仅具有DNA多聚酶的作用，而且具有反转录酶活性，可利用其双 重作用在同一体系中直接以mRNA为模板进行反转录和其后PCR扩 增，从而使mRNA的PCR步骤更为简化。所需样品量减少到最低限 度，临床小样品的检测非常有利。用一步法扩增可检测出总RNA中 小于1ng的低丰度mRNA。该法可用于低丰度mRNA的cDNA文库 的构建及特异cDNA的克隆，并有可能与Taq酶的测序技术相组合， 使得自动反转录、基因扩增与基因转录产物的测序在单管中进行。 RT-PCR一步法和两步法 两步法：由于单管反应时RT和PCR都不能在最佳条件下 进行并且 容易相互干扰，常只适宜用基因特异引物扩增 较短的基因，及定量PCR。两步法则是将RT和PCR分别 进行，这样使得两个反应充分发挥各自的特点，更为灵 活而且严谨，适合那些GC含量、二级结构严重的模板或 者是未知模板，以及多个基因的RT-PCR。 RT-PCR一步法和两步法 兼并引物PCR（Degenerate Primer） 密码子的简并性 氨基酸 密码子数 、 、 、 、 简并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能 性的不同序列的混合物。简并度越低，产物特异性越 强。设计引物时应尽量选择简并性小的氨基酸，并避 免引物3末端简并，因为3端最后3个碱基的退火足以 在错误位点起始PCR；次黄嘌呤可以同所有的碱基配 对，降低引物的退火温度。 兼并引物PCR（Degenerate Primer） 巢氏PCR（Nested PCR） 巢氏PCR需要两到三对引物，一般采用第一套引物扩增15- 30个循环，再用扩增DNA片段内设定的第二套引物扩增15- 30个循环，这样可使待扩增序列得到高效扩增，而次级结构 却很少扩增。套式引物PCR减少了引物非特异性退火，从而 增加了特异性扩增，提高了扩增效率。 若将套式PCR的内外引物稍加改变，延长外引物长度（25- 30bp），同时缩短内引物长度（15-17bp），使外引物先在 高退火温度下复性，做双温扩增，然后改换至三温循环，使 内引物在外引物扩增的基础上，在低退火温度复性，直到扩 增完成，这样就可以使两套引物一次同时加入。 反向PCR（Inverse PCR） 反向PCR的目的在于扩增一段已知序列旁侧的DNA，也就 是说这一反应体系不是在一对引物之间而是在引物外侧合成 DNA。反向PCR可用于研究与已知DNA区段相连接的未知染 色体序列，因此又称为染色体步移。这时选择的引物虽然与 核心DNA两末端序列互补，但引物3端是相互反向的。 反向PCR的操作流程：扩增前先用限制性内切酶酶切样品 DNA，然后用DNA连接酶连接成一个环状分子，通过反向 PCR扩增引物的上游片段和下游片段。 选择多种限制性内切酶，基本准则是选择不能在 非酶切位点切断靶DNA的酶。裂解核心区的内切 酶使反向PCR只能扩增引物所定模板(依赖于引物) 的上游或下游区，而不裂解核心区的酶则使两侧序 列都扩增 Southern杂交来确定内切酶用以产生大小适于环化 及反向PCR的片段的末端片段 大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列 ，所以往往需要两组到三组嵌套引物 反向PCR（Inverse PCR） 不对称PCR（Asymmetric PCR） 不对称PCR的基本原理是采用不等量的引物产生大量的 单链DNA（ss-DNA）。这两种引物分别称为限制性引物与 非限制性引物；其最佳比例一般为1：501：100，关键是 限制引物的绝对量。限制性引物太多太少，均不利于ss- DNA。 不对称PCR反应过程：一般来说，在不对称PCR反应中 ，在 开始的20-25个循环中，两个比率不对称的扩增引物产 生出双链DNA，当限量的那个引 物耗光后，随后的5-10个 循环就产生出ssDNA。 产生的ds-DNA与ss-DNA由于分子量不同，可以通过电 泳分离。 一般对100l PCR反应体系而言，当引物比率 为50pmo:0.5pmol，经过30个循环 后，大约可产 生1-3pmol的ssDNA。ssDNA的产量可用下列几 种方法来估计: a)在ss-DNA合成过程中，掺入32P-dNTP。取 10%的反应产物，经过琼脂 糖电泳分离后，放 射自显影。 b)取5%的反应物来走 胶，转移到膜上，并用与 ssDNA互补的寡核苷酸为探针杂交。 不对称PCRssDNA产物量 n解决不对称PCR反应扩增效率低的方法 ： n增加PCR循环的次数 n在最后五个循环中多加Tab聚合 酶(2U) n试一下相反的不对称引物比率。有时， 相反的不对称引物比率可能给出不 同产 量的ssDNA。 In situ PCR 原位PCR就是在组织细胞里进行PCR 反应，它结合了具有细胞定位能力的原 位杂交和高度特异敏感的PCR技术的优 点，是细胞学科研与临床诊断领域里的 一项有较大潜力的新技术. 原位PCR是Hasse等于1990年建立的，实验用的 标本是新鲜组织、石蜡包埋组织、脱落细胞、血细胞 等.其基本方法为固定组织或细胞:将组织细胞固定于 预先用四氟乙烯包被的玻片上，并用多聚甲醛处理， 再灭活除去细胞内源性过氧化物酶.蛋白酶K消化处 理:用60ug/ml的蛋白酶K将固定好的组织细胞片 55消化处理2h后，962min以灭活蛋白酶K. PCR扩增:在组织细胞片上，加PCR反应液， 覆盖并加液体石蜡后，直接放在扩增仪的金属 板上，进行PCR循环扩增.有的基因扩增仪带有 专门用于原位PCR的装置.杂交:PCR扩增结 束后，用标记的寡核苷酸探针进行原位杂交. 显微镜观察结果. n原位PCR既能分辩鉴定带有靶序列的细 胞，又能标出靶序列在细胞内的位置， 于分子和细胞水平上研究疾病的发病机 理和临床过程及病理的转归有重大的实 用价值.其特异性和敏感性高于一般的 PCR. 原位PCR 连接酶链反应(Ligase chain reaction，LCR)，是一种新 的DNA体外扩增和检测技术，主要用于点突变的研究及靶基因 的扩增. 连接酶链反应是Backman1997年为检出靶基因序列中的点 突变而设计发明，并申报了专利.1988年Landegren也进行了 该项研究.1988年Backman等又因分离热稳定的连接酶，而申 报专利，1991年Backman和Barany分别用耐热DNA连接酶进行 了LCR试验.耐热DNA连接酶可以在热循环中保持活性，提高连 接反应的特异性，排除了背景扩增和免除了不断补充酶的繁 琐程序. 连接酶链反应(Ligase chain reaction，LCR) LCR的基本原理为利用DNA连接酶.特异地将双链DNA片 段连接，经变性-退火-连接三步骤反复循环，从而使靶基因 序列大量扩增.其程序为:在模DNA、DNA连接酶、寡核苷酸引 物以及相应的反应条件下，首先加热至一定温度下(94 95)使DNA变性，双链打开，然后降温退火(65)，引物与 之互补的模板DNA结合并留下一缺口，如果与靶序列杂交的 相邻的寡核苷酸引物与靶序列完全互补，DNA连接酶即可连 接封闭这一缺口，则LCR反应的三步骤(变性-退火-连接)就 能反复进行，每次连接反应的产物又可在下一轮反应中作模 板，使更多的寡核苷酸被连接与扩增.若连接处的靶序列有 点突变，引物不能与靶序列精确结合，缺口附近核苷酸的空 间结构发生变化，连接反应不能进行，也就不能形成连接产 物. 连接酶链反应(Ligase chain reaction，LCR) chain reaction (LC