如何选择色谱柱

如何选择色谱柱，比较一下 C-18 及 C-8 柱的硅烷基质 C-18 和 C-8 硅烷色谱柱是高效液相色谱（HPLC）中最常使用的色谱柱，而且，在美 国市场上有多于 100 种 C-18 和 C-8 色谱柱出售。面对这么多可供选择的色谱柱，分析工作 者很难从中选出适当的色谱柱来具体使用，同时更难选择出一根合适的替换柱。 对于非极性样品（如小分子芳烃）或弱极性样品（如对羟基苯甲酸酯） ，C-18 和 C-8 色谱 柱是最容易选择的。对于这类样品，色谱柱之间的主要差异在于保留因子（k） ；而在选择 性方面却只有微小的差异。但对于极性和中等极性样品色谱柱的选择却相当困难。例如含 氨基或酸性基团的药物化合物。分析工作者会发现极性样品在保留时间、选择性和峰形都 有很大的差别。 色谱柱的选择性和峰形受到担体硅胶的影响远大于键合相的影响。另外，有研究报道 在反相色谱中表面硅烷醇、硅酸及金属杂质的影响。在特殊情况下，选择性的差异可由填 料制备时使用的键合过程决定的。 通常情况下，色谱工作者选择 HPLC 色谱柱是通过比较由色谱柱供应商所提供的填料介质 的规格来决定的。这些规格内容包括：表面积、末端封尾、含碳量、颗粒形状、颗粒尺寸、 孔径、孔容积、装填密度和键合度。含碳量和键合度仅由色谱制造商提供，没有这些规格 使用者不可能计算出碳的克数，也不可能计算出一根色谱柱中键合相的微分子数。分析工 作者可使用这两个数据来估计一根色谱柱的疏水性质。然而，即使制造商提供所有上述规 格数据，使用者也不可能精确地预测出色谱柱对含有极性官能团的化合物的选择性。 由于色谱的保留时间是基于分析物和填充基质之间许多微妙的相互作用，我们建议使 用混合物测试来比较填充基质的规格与性能。Engelhardt 和他的同伴回顾了硅烷反相色谱 的特性，并且提出用溶解物试验来描述固定相的疏水性和亲硅基醇特性。另外有一些人也 改进了测试条件和方法来解释那些色谱数据，但他们只测试了很少的商品色谱柱，并且在 他们的测试混合物中没有羧酸。在本文中，我们使用了一个含有羧酸的测试混合物来收集 了 86 根 C-18 和 C-8 硅烷色谱柱（见表 1）的数据。我们将测试结果详细描述如下。表 1： 研究中所使用的色谱柱的生产商(略)。 在我们的比较中，我们使用了含有 6 种物质的测试混合物，此 6 种物质列于图 1。每 一种物质在测试混合物中都起特殊的作用。尿嘧啶是用于产生空体积。甲苯是测试色谱柱 的疏水性。吡啶和 N，N-二甲基苯胺是用来测试硅醇基对碱性物质的活性的碱性胺类物质。 苯酚是一种弱酸，用于与吡啶联合起来确定活性担体硅的数量。4-正丁基苯甲酸是一种用 于测试硅醇基对酸性物质的活性羧酸，此方面是色谱柱制造者开发碱性去活色谱柱来作胺 类物质分析时经常忽略的。 我们使用的流动相是含有 65%的乙腈和 35%的浓度为 0.05M 的磷酸钾混合溶液，pH 值为 3.2。pH=3.2 的缓冲溶液可使 4-正丁基苯甲酸质子化，同时可提高吡啶和 N，N-二甲 基苯胺的保留时间的重现性。我们发现使用没有加缓冲溶液的流动相，如 65%乙腈和 35% 水，即使我们使用同一瓶流动相，也无法得到重现性较好的保留时间和峰形。高离子强度 的缓冲溶液，如本次测试所使用的 0.05M 的缓冲溶液，会抑制一些硅醇基的活性（2，5） ， 但对于将胺从一些非碱性去活的反相色谱柱中洗脱下来，有一些抑制作用是必要的。 我们测试过另外两种缓冲溶液，但它们的作用均少于 pH=3.2 的 0.05M 磷酸钾溶液。0.01M 磷酸钾缓冲溶液在 pH=3.2 时，胺类化合物在有些色谱柱中产生前移峰。0.05M 磷酸钾缓冲 溶液在 pH=7 时，胺类物质产生的峰形比在 pH=3.2 时更好。吡啶和 N，N-二甲基苯胺的 pKa 均大约为 5.2；因此，这些组分在 pH=7 时未质子化并且呈中性，同时并不与强酸性的 硅醇基发生离子交换作用。 液相色谱柱原理 与液相色谱柱的性能相关的因素很多，基质（matrix）或者说担体、载体的化学性质、键 合相（固定液）的化学性质、填料形状大小粒度分布、碳量和键合度等等。 色谱柱填料可以由基质直接构成，如硅胶、氧化铝、高交联度的苯乙烯-二乙烯苯或者甲基 丙烯酸酯等等；也可以在这些基质的基础上涂布或化学键合固定液来构成，如：最经典的 各种 ODS 柱、氨基柱、氰基柱等。 一、我们先来看看各主要基质的特点： 1、 硅胶 硅胶是陶瓷性质的无机物基质，刚性大，不易变形。化学性质较稳定，但对于水溶液尤其 碱性水溶液仍然是不稳定的，即使表面经过良好的化学键合，覆盖了固定液，还是要注意 水、碱性溶液、酸性溶液对硅胶的溶解作用，基质或者说是柱床（packed bed）溶解对色谱 柱的影响是致命的。以硅胶为基质的填料构成了目前绝大多数的色谱柱填料。纯硅胶填料 适宜分离溶于有机溶剂的极性、弱极性的非强离解型的化合物，硅胶也可以做凝胶色谱但 柱效较低。硅胶基质键合固定相的高压液相填料，有其他填料无法比拟的高分离效能。 2、 二氧化铝 二氧化铝和硅胶相似，但对水溶液、酸性碱性水溶液溶液更加不稳定。所以，极少用作键 合固定相的基质，也是适宜分离溶于有机溶剂的极性、弱极性的非强离解型的化合物，尤 其是分离芳香族碳氢化合物。酸性易离解的化合物容易在二氧化铝上形成死吸附。另外， 氧化铝分离几何异构体能力优于硅胶。 3、 聚合物填料 聚合物基质受压会变形，压力限度低但 pH 使用范围宽。苯乙烯-二乙烯苯基质疏水性强， 使用任何流动相，在整个 pH 范围内稳定，可以用强酸、强碱来清洗色谱柱。甲基丙烯酸 酯基质比苯乙烯-二乙烯苯疏水性更强，但可以通过适当的功能基修饰变成亲水性的。由于 不耐压、有溶胀性，所以聚合物填料适宜用于大分子像蛋白质或合成的高聚物，另外还可 以制成分子排阻、离子交换柱。近年发展迅速的大孔树脂，实际上主体就是苯乙烯-二乙烯 苯聚合物或类似的合成高聚物。 由于硅胶基质的绝对地位，以下主要以硅胶为例。 二、形状大小粒度分布 基质要成为填料，首先要制成合适的形状和大小。硅胶形状有：薄壳型、无定形全多孔、 球形全多孔，另外还有先做成微珠再堆积成球形全多孔的。通常只说不定形、球形。无定 形全多孔的填料容易制备、价格低、粒度分布较均匀，但涡流扩散大，渗透性差，比较难 填装出稳定的柱床，一般用来做制备柱。球形全多孔填料涡流扩散小，渗透性好；如果是 硅胶先做成珠子再堆积而成的话，具有传质阻抗小、载样量大的优点，柱效也更高。球形 填料外形对称，比较容易填出稳定的柱床。填料的大小一般不能直接测量，因为填料粒度 有一定分布范围，一般给出的大小只是用一定方法测得的表观大小。填料大小与柱效、柱 压的关系为：柱效与填料大小成反比，柱压与填料大小的二次方成正比。所以，快速分析 柱使用 3 微米粒度的填料、一般做成 5 厘米长，就是为了降低柱压；需要注意到降低粒度 所得到的柱效增加跟不上柱压的增加快。 基质做成合适的形状和大小后，可以通过各种化学修饰（modified）的手段，获得各种不 同选择性的填料。有时候，我们增加柱长、降低填料粒度都无法把一个化合物分离的更好， 这时候就要考虑使用选择性更好的填料。 三、碳量和键合 硅胶主要通过表面的极性硅醇基保留极性分子，属于正相分离模式。通过硅烷化技术，可 以把各种不同性质的功能团（functional group）建合到硅胶表面，例如：键合十八烷基 （ODS，octadecyl silane） 、辛烷基、甲基、苯基增加对非极性物质分子的保留，构成反相 色谱；键合带二醇基、氨基、氰基等极性基团的硅烷改善对某些极性分子的保留，构成正 相色谱；键合有醚基的键合相构成中等极性的正相或反相色谱；键合强酸性磺酸型或者强 碱性季铵盐型键合相，构成离子交换色谱。 对于硅胶反相键合相填料，键合的烃基，链长增加，载样量增大，k 值增大，对非极性物 质的保留时间延长。填料含碳量用元素分析来测量。通常，所得结果直接用来表示填料的 碳量。在相同的硅胶基质上，相同的键合度，配基分子量越大，碳量越大；因此，C18 固 定相比 C1 固定相有更高碳量。相同配基，相同硅胶；覆盖率越高，碳量越大。对于相同 配基，相同的表面覆盖率；填料的碳量随孔径的增加而减少，因为比表面积下降了。因此， 我们可看到，只用碳量是不能衡量填料的保留性能的，所以要引入键合度概念。 键合度有时候也叫做表面覆盖率。键合度是键合相表面组成的一个非常重要的量，也是决 定填料的选择性的一个重要的参数。 键合相是用有机硅烷与硅胶表面进行化学反应而产生的，目的是获得均匀的单分子层。在 键合反应中可使用单功能基、双功能基和三功能基的硅烷，多功能基的硅烷可以获得更高 的键合密度。填料的选择性决定于键合的密度。尤其是在分离碳水化合物时，不同键合密 度表现出不同的选择性。多数商品键合柱属于单功能基的，单功能基的键合覆盖率更容易 预测，因为不会有第二功能基产生复杂的副反应，用单功能基硅胶可以得到高的重现性， 但是，硅胶表面键合单功能基硅烷比键合多功能基的更容易水解。三功能基硅烷在硅胶表 面的键合，更难重现，折衷一下，键合二功能基，使得更耐水解。对于在高或低 pH，易于 水解的流动相中，最好使用耐用的多功能基键合硅胶。所有硅胶基质的离子交换填料都是 三功能基的。如果氰基填料用于反相色谱，硅胶基质（低孔体积）的用三功能基硅烷较好。 一些生产商会生产专门用于反相色谱的氰基键合相。 对于许多反相填料，要进行二次键合以覆盖硅胶表面未被反应的硅醇基。通常使用小分子 硅烷，如三甲基氯基硅烷（TMCS） ，以便获得最大的覆盖率。这个步骤称为封端（end capped） 。在反相色谱中，封端用于多数的键合相；用在正相或其他色谱的键合相一般不用 封端。没有封端的反相色谱填料通常比封端的有复杂多样的选择性。但是，碱性物质在不 封端的填料上，容易产生拖尾。三甲基硅烷基（封端基团）在酸性条件下容易水解。因此， 对于不同的被分析物要按实际情况选择封端或者不封端的填料，封端的填料也不能在 pH2 的条件下使用。 四、色谱分离模式：正相、反相、离子交换、离子抑制、亲水作用等。 正相色谱是色谱的经典形式，使用极性固定相和非极性流动相。洗脱物通过其极性基团和 固定相上的极性基团作用被保留。这种应用，经典的是使用未键合的硅胶和氧化铝，但现 在使用的极性键合相有以下优点：键合相平衡快，对流动相中微量的水不敏感，和产生不 同的选择性。二醇基键合相比纯硅胶极性小，平衡速度快；氰基键合相是保留能力最小的 正相吸附剂；氨基键合相适宜分离芳香族碳氢化合物 反相色谱已成为最流行的色谱分离模式。反相色谱中，固定相非极性，流动相极性。典型 的流动相一般是水或水系缓冲液与甲醇、乙腈或四氢呋喃的混合物。典型的固定相是用脂 肪烃硅完化的硅胶键合相，其它用于反相色谱的基质有石墨化碳和苯乙烯-二乙烯苯基质。 反相色谱的性能还受残留的硅醇基的活性的影响。硅醇基与洗脱物的极性基团作用。因此， 根据硅醇基的活性不同，填料显示出不同的选择性。而且，常能观察到碱性物质在硅醇基 活性高的填料上产生拖尾峰。修饰硅醇基活性的一个办法是封端，即用硅烷化试剂把硅醇 基转变成三甲基甲硅烷基基团。不过，即使是作了封端，基质表面的硅醇基密度还是比键 合配基的密度大。硅醇基的活性也和硅胶的预处理（基质灭活） 、硅胶纯度有关。碱性分析 物的色谱分析推荐使用高纯度硅胶基质、充分封端的键合相。未封端的填料在许多应用中 有可以获得不同选择性的优点。 使用带有离子电荷的固定相，使根据洗脱物电荷进行分离成为可能。对于硅胶基质的离子 交换填料，离子基团通过标准的硅烷化技术键合到硅胶表面。对于聚合物基质的离子交换 填料，离子交换基团分布于交联聚合物的整体（through the matrix） 。有四种离子交换填料： 强/弱阳离子交换填料和强/弱离子交换填料。弱离子交换填料的特征是电量与 pH 值有函数 关系。以羧酸基为功能基的离子交换剂是弱阳离子交换剂的代表。弱阴离子交换剂由一级、 二级、三级铵为功能基。大部分强离子交换剂的电荷与 pH 值无关。四级铵形成强阴离子 交换剂，而磺酸基构成了强阳离子交换剂。所有这些离子交换基团都可以在聚合物基质上 见到，主要用于分离生物大分子。除了弱阳离子基团外，其它功能基都可以键合到硅胶上。 离子抑制（离子对）色谱广泛用于在低 pH 下分析洗脱液中的有机酸。它只是反相色谱的 一个分支。特殊的聚合物固定相适用于这种应用，因为耐酸碱范围大。亲水作用色谱是正 相色谱扩展到水系洗脱液。用极性固定相配合水-有机流动相。与反相色谱相反，保留随有 机相的增加而增加。这种应用多用胺丙基键合相作固定相。当然，硅胶本身，二醇类或其 他极性固定相也可以用。通常应用胺丙基固定相来分离碳水化合物。专门设计用于这种应 用的柱子称为糖柱