感冒清热颗粒有效成分及有效部位的体外抗病毒追踪 毕业论文.doc

本科生毕业论文 论 文 题 目：感冒清热颗粒有效成分及有效部位的体外抗病毒追踪 学 生 姓 名： 学 号： 20086870 学 院： 药 学 院 专 业 方 向： 制药工程本科 班 级： 2008级1班 指 导 教 师： 论文完成日期： 2012年6月 毕业论文（设计）诚信声明书本人声明：本人 姚梅悦 （学号： 20086870 ）所提交的毕业论文 感冒清热颗粒有效成分及有效部位的体外抗病毒追踪 是本人在指导教师 周长征 老师指导下独立研究、写作的成果，论文中所引用他人的无论以何种方式发布的文字、研究成果，均在论文中加以说明；有关教师、同学和其他人员对本文的写作、修订提出过并为我在论文中加以采纳的意见、建议，均已在我的致谢辞中加以说明并深致谢意。论文作者： （签字） 时间： 2012年 6 月9 日指导教师已阅： （签字） 时间： 2012年 6 月9 日毕业论文（设计）版权使用授权书本毕业论文 感冒清热颗粒有效成分及有效部位的体外抗病毒追踪 是本人 姚梅悦 （学号： 20086870 ）在校期间所完成学业的组成部分，是在指导教师 周长征 老师的指导下独立完成的。因此，本人特授权山东中医药大学药学院可将本毕业论文的全部或部分内容编入山东中医药大学药学院本科生优秀毕业论文集（非正式出版）。论文作者： （签字） 时间： 2012年 6 月9 日指导教师已阅： （签字） 时间： 2012年 6 月9 日感冒清热颗粒有效成分及有效部位的体外抗病毒追踪 摘要 目的：研究感冒清热颗粒的制备处方，探讨感冒清热颗粒不同成分，不同极性溶剂提取物对呼吸道合胞病毒的体外抗病毒活性 方法：采用水，95%乙醇，乙酸乙酯溶剂法对感冒清热颗粒制备处方11味药分别进行提取，得到不同部位提取物。并利用水蒸气蒸馏法提取薄荷，紫苏叶，荆芥穗的挥发油。将不同部位，不同成分的提取物做二倍比稀释，一次横向接种于96孔板内的vero单层细胞上，然后以rsv攻击，同时设有病毒对照组和细胞对照组，于37，5%co2恒温箱培养，逐日观察细胞病变，病毒对照组细胞病变率达到90%，利用酶标仪测量其吸光度，得到治疗指数。结果：白芷，葛根，荆芥穗，薄荷，防风，紫苏叶的水溶性成分对呼吸道合胞病毒具有抑制作用，其中荆芥穗，薄荷，有效指数为16；其他极性溶剂提取物抗病毒效果均不明显。因此感冒清热颗粒在抗呼吸道合胞病毒中的有效成分应该是薄荷及荆芥穗的水溶性成分。关键词 呼吸道合胞病毒；感冒清热颗粒；提取；体外抗病毒cold heat granules effective component parts and effective in vitro antiviral trackingabstract objective: to study the preparation of ganmao qingre granules on prescription, cold heat granules with different compositions, different polar solvent extract against respiratory syncytial virus in vitro antiviral activitymethods: with the water,95% ethanol, ethyl acetate solvent method in ganmao qingre granules preparation prescription of11drugs were extracted, get of extracts from different parts of. and the use of steam distillation in the extraction of perilla leaf, mint, herba schizonepetae volatile oil. the different parts, different components of the extract of two fold dilution, a transverse vaccination at 96hole board within the vero monolayer cell, and then to rsv attack, at the same time a virus control group and cell control group, at 37 ,5%co2constant temperature incubator, the daily observation of cytopathic, virus control group cell lesion rate of 90%, using the enzyme mark instrument measuring the absorbance, get the therapeutic index.results: angelica, radix puerariae, schizonepeta spike, mint, windproof, perilla leaf water soluble components of respiratory syncytial virus inhibition, in which spikes of schizonepeta tenuifolia, mint, effective index of 16; other polar solvent extract of antiviral effects are not obvious. so cold heat granules on anti respiratory syncytial virus in the effective ingredient should be mint and spikes of water-soluble components.分享到 翻译结果重试抱歉，系统响应超时，请稍后再试 支持中英、中日在线互译 支持网页翻译，在输入框输入网页地址即可 提供一键清空、复制功能、支持双语对照查看，使您体验更加流畅key words respiratory syncytial virus;cold heat granules;extraction;in vitro antiviral呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, rsv)属副粘病毒科，肺炎病毒属。流行于每年的冬季或早春，成为流行很广的急性呼吸道疾病。rsv毛支患儿与哮喘患儿存在相同的外周血细胞因子ifn-、il-4、il-10、tgf-、il-17水平的改变,这可能是其共同的发病机制之一1。20092010年本地adv和rsv感染全年流行,无明显季节性。儿科住院呼吸道感染患儿adv和rsv感染临床表现方面无特殊,病原诊断需要实验室协诊2。感冒清热颗粒处方：荆芥穗 200g 薄荷 60g 防风 100g 柴胡 100g 紫苏叶 60g 葛根 100g 桔梗60g 苦杏仁 80g 白芷60g 苦地丁 200g 芦根 160g。该药是临床应用多年的有效验方，具疏风散寒，解表清热的功效，用于治疗伤风感冒引起的头痛发热、咳嗽咽干、全身酸痛、鼻流清涕等病症，在感冒初起时及时服用，效果尤佳。监此，对感冒清热颗粒配伍处方的有效成分及有效部位进行体外抗病毒实验，旨在找寻对呼吸道合胞病毒有效地成分及部位。1材料1.1实验材料1.1.1药材荆芥穗、薄荷、防风、柴胡、紫苏叶、葛根、桔梗、苦杏仁、白芷、苦地丁、芦根1.1.2病毒株和细胞株呼吸道合胞病毒，引自中国疾病预防控制中心病毒病研究所流感病毒研究室。细胞株：vero1.2试剂与仪器1.2.1提取溶剂水、95%乙醇、乙酸乙酯1.2.2细胞培养试剂1640细胞培养液(美国gibco 产品，含10%牛血清)； 1640细胞维持液(美国gibco产品，含2%牛血清)；ph7.4的磷酸盐缓冲液（pbs）（含nacl 8 g、kcl 0.2 g、kh2po4 0.2 g、na2hpo4 2.9 g，加三蒸水至1 000 ml，过滤除菌，分装置4 备用）；中性红染液，中性红脱色液1.2.3提取装置圆底烧瓶、冷凝管、挥发油提取器1.2.4实验仪器仪器名称生产厂家旋转蒸发仪上海申生科技有限公司水浴锅常州汉彩实验仪器制造有限公司磁力搅拌电热套菏泽市牡丹区百科教学仪器厂mk3酶标仪labsystems公司倒置显微镜ckx-31olympus公司二氧化碳培养箱 隔水式美国forma公司高速台式离心机tgl-16型上海医疗器械六厂超低温冰柜 -80 ，725型thermo forma公司低温冰柜 -40 三洋公司荧光倒置显微镜日本奥林帕斯公司微量移液器法国gilson公司2实验方法2.1有效成分及有效部位的提取2.1.1回流提取法按照表1所示的分类方法，将中国药典2010年版感冒清热颗粒中的11味中药及按照处方量混合后的药物分别用4倍量乙醇回流提取，滤过，回收乙醇并回收乙醇至浓度为(1ml/g)3，编号（112）；用4倍量水提取，滤过，蒸去部分水分并浓缩至（1ml/g）保存至ep管中，编号（13-24）；用4倍量乙酸乙酯回流提取，滤过，蒸去乙酸乙酯，保留粉末状药物，编号（25-36）。表1 不同成分，不同部位提取物编号编号芦根白芷苦地丁桔梗葛根荆芥穗薄荷防风柴胡紫苏叶苦杏仁混合乙醇123456789101112水131415161718192021222324乙酸乙酯2526272829303132333435362.1.2挥发油提取水蒸气蒸馏法荆芥穗挥发油提取：不粉碎，浸泡40min，回流提取5h。4，编号37薄荷挥发油提取：料水比1:7，回流提取6h。5编号38紫苏叶挥发油提取：料水比1:40，浸提温度60，浸泡60min，回流提取2h。6编号392.2提取物体外抗病毒实验2.2.1细胞复苏传代将液氮冻存的vero细胞在37 水浴1 min内迅速融化，悬浮于培养液中，于细胞培养瓶中37 、5%co2静止培养，3 d后长成单层，用0.25%胰酶消化，1:2传代，细胞长成单层时用于实验。2.2.2病毒扩增将呼吸道合胞病毒接种于已经长成单层的vero细胞上，加2%1640维持液后置37 、5%co2条件下培养，3 d（出现90%以上的病变）后，反复冻融3次，吹打离心（3000 r/min，10 min），取上清液定量分装，-80 冰箱冻存备用。1.3.3.3提取物处理1-12号为水提物，将药物分装置小青瓶中，高压灭菌；25-36号为固体粉末，用2%1640,1：1溶解，使浓度为1ml/g。2.2.3抑制呼吸道合胞病毒实验将各供试样品用2%1640细胞维持液分别作2倍系列稀释共12个稀释度，按稀释度顺序以每孔100 l的量横向接种于96板孔中的单层vero细胞上，每孔再加入用2%1640（1:5007）稀释的呼吸道合胞病毒100 l，同时设病毒对照组及细胞对照组。37 、5% co2培养，每日观察病变。病毒对照组出现90%以上的病变后，用电子显微镜观察缩小范围，进行二次试验，待二次试验病毒对照组出现90%时，终止培养。2.2.4测量吸光度将96孔板中的培养液拍出，每孔加入100l中性红染液，放入37培养箱反应1h,取出，倒出染液，小水流自来水冲洗3-5遍，甩干，每孔加入100l脱色液，37恒温箱放置15min后酶标仪540nm处，测od值。3实验结果3.1一次实验结果通过电子显微镜观察 ，14、17、18、19、20、22号具有一定的抑制rsv作用。即白芷、葛根、荆芥穗、薄荷、防风、紫苏叶的水溶性成分。上述供试品可进行二次试验。3.2二次试验结果利用酶标仪测定的吸光度8结果如下（表2）。表2 540nm处抑毒实验后各浓度的吸光度ml/g12-12-22-32-42-52-62-72-82-92-102-11140.2350.2320.6680.6280.4320.3310.2340.3040.2030.2850.1780.255170.3660.3940.1200.2060.7720.2340.3040.2830.2990.2780.2610.270180.2480.2450.4290.3700.4460.6710.6430.8130.6060.4020.2080.164190.2960.3330.6970.8490.7510.5390.3480.1970.2660.1380.2260.364200.3370.1910.3760.3930.4970.5150.3990.1960.1540.3440.1430.229220.2060.5820.4420.3250.2810.1410.1730.1300.1970.2750.2350.124virus0.2960.2520.3680.1940.1770.2200.3680.3800.3700.3740.1960.384正常0.8780.9480.8150.9110.8330.9200.8391.1720.9281.0260.9750.819细胞存活率=正常-死亡/正常9，在这里采用吸光度计算细胞存活率=样品吸光度/正常细胞吸光度*100%，若50%,则视为有效。分析数据，正常细胞吸光度=0.922 ，50%正常细胞=0.461.结合第一组数据，50%，的有14号2-2,2-3；17号2-4；18号2-52-8；19号2-22-5；20号2-4，2-5；22号2-1。3.3对呼吸道合胞病毒的抑制作用已知在细胞存活率大于50%之前的浓度为药物半数中毒浓度（tc50），细胞存活率大于50%最后一个浓度为药物半数有效浓度（ec50），并确定抑毒指数（ti=tc50/ec50）10。14号为白芷的水溶性成分:ti=2-1/2-3=4；17号为葛根的水溶性成分：ti=2-3/3-4=2；18号为荆芥穗的水溶性成分：ti=2-4/2-8=16；19号为薄荷的水溶性成分：ti=2-1/2-5=16同理，20号防风水溶性成分抑毒指数为4；22号紫苏叶水溶性成分抑毒指数为2。4 分析与讨论根据结果，可知，效果最好的为荆芥穗，薄荷的水溶性成分。葛根，紫苏叶水溶性虽然指数有达到2，但只能说明对rsv有一定的抑制效果，但是指数较低，且有效浓度缩对应的细胞存活率，葛根77.2%，而紫苏叶有效浓度对应的细胞存活率为63.1%，从两者分析，数据对于临床研究意义不大，对于抗病毒研究价值较低。 薄荷为唇形科植物薄荷 mentha haplocalyx briq.的干燥地上部分。为传统的辛凉解表药,全国大部分地区皆有种植,江苏等地为主要产区,味辛,性凉,具有疏风、散热、疏肝、辟秽、解毒的功效。用于外感风热、头痛目赤、咽喉肿痛、食滞气胀、口疮、牙痛、疮疥等症的治疗。同时,薄荷也是中药复方银翘散的组成药物。从银翘散的方源及其制方原则,结合药物的效用与抗病毒活性考察,薄荷为银翘散抗流感病毒的主要药物,且酚类成分为其主要的有效部位。11分析薄荷水溶性成分细胞存活率，如下（表3）表3薄荷水溶性有效成分细胞存活率2-2 2-3 2-4 2-575.6% 92.1% 81.5% 58.5%但是薄荷挥发油在抑制病毒方面没有效果，结合薄荷不同组分对小鼠急性毒性实验比较研究12,薄荷挥发油没有抑毒效果的原因，主要是因为其毒性过大。薄荷不同组分对小鼠急性毒性强度为:薄荷挥发油薄荷水提组分薄荷全组分,其毒性成分与中毒机理尚待进一步研究。研究了滇产38个薄荷(mewtha canadensis linn)样品，测定了样品的得油率及化学成分。滇产薄荷的得油率在0.18%0.52%之间。从挥发油中鉴定出了100多种化学成分，主要含醇、酮、酯、萜烯类化合物。栽培的家薄荷挥发油富含香芹酮、柠檬烯，其化学分类属于香芹酮系列。野生薄荷挥发油富含薄荷醇和薄荷酮，属于薄荷酮系列；部分野薄荷样品，富含香芹酮、环氧辣薄荷烯酮或芳樟醇，属于混合系列。13因此看出，薄荷在不同地区挥发油成分不同，可猜想水提成分也不相同，从存活率看出，薄荷的水提成分，抑制呼吸道合胞病毒比较有效，可以进一步研究不同地区薄荷的抑毒效果，并可进一步分离研究。荆芥穗主要成分为挥发油,含有多种黄酮类物质及化合物,它们的活性与荆芥穗的功效相关联。荆芥穗具有发表散风、透疹消疮、炒炭止血等功效,临床多用于外感表证、麻疹不透、风疹瘙痒、吐衄下血等证,是各种中药复方的重要组成药物14。荆芥穗的水溶性成分细胞存活率，如下（表4）表4 荆芥穗的水溶性有效成分细胞存活率2-5 2-6 2-7 2-872.8% 69.7% 88.2% 65.7%荆芥穗中分离得到8个化合物,分别鉴定为反式桂皮酸(1)、-谷甾醇(2)、3-羟基-4(8)-烯-p-薄荷烷-3(9)-内酯(3)、芹菜素(4)、schizonepetosides b(5)、木犀草素(6)、tilianin(7)和橙皮苷(8) 15,该植物有较好的研究价值，现在仅是明确了水提部位有抑制呼吸道合胞病毒的作用，可进一步实验，验证某个成分的效果。而荆芥穗的挥发油无法抑制呼吸道合胞病毒,荆芥穗的主要成分是挥发油，因此相对薄荷，其研究价值略低。趋于抑毒指数为4的，白芷与防风，虽然达到4，但是，可从细胞存活率看出白芷的存活率高于防风，防风水溶性成分的细胞存活率，都接近50%，即效果并不明显。白芷水溶性对应的细胞存活率也较低。如下可知（表5）表5 白芷、防风的水溶性有效成分细胞存活率2-22-32-42-5白芷72.50%68.10%防风53.90%55.86%白芷性味归经：辛，温。归肺、胃经。祛风散寒，通窍止痛，消肿排脓，燥湿止带。来源中国：为伞形科植物禹白芷、兴安白芷、川白芷、杭白芷或云南牛防风的根，禹白芷主产河南禹州一带。北方的一些省区有栽培，多自产自销，少数调省外。该品含挥发油，香豆素及其衍生物，如当归素、白当归醚、欧前胡乙素、白芷毒素等。还含有挥发油，油中有3-亚甲基-6-环己烯、十一炭烯-4、榄香烯、十六烷酸、壬烯醇等。通过各种现代色谱技术，研究中药川白芷angelica dahurica（fisch）benthet hook的化学成分，对川白芷乙醇提取物的氯仿萃取相进行分离纯化，得到8个化合物，根据波谱数据结构鉴定为：suberosin（1），3r，8s-falcarindiol（2），欧前胡素（imperatorin，3），异欧前胡素（isoimperatorin，4），8-甲氧基-5羟基补骨脂素（cnidilin，5），佛手柑内脂（bergapeen，6），-谷甾醇（-sitosterol，7），豆甾醇（stigmasterol，8）。化合物1和2为首次从川白芷中分离鉴定16。白芷的水提成分具有一定的抑制呼吸道合胞病毒的作用，其他部位作用不明显，但是白芷乙醇提取物镇痛作用明确17，其价值可体现在其他方面。防风是伞形科多年生草本植物防风的根。主产于黑龙江、四川、内蒙古等地。生用。可到大有恒中药材库查询购买。现代药理作用：1解热作用2镇痛、镇静作用3抗菌、抗炎作用4对免疫功能的作用。从防风根的乙醇浸出物中分离鉴定出8个化合物，通过理化数据及光谱分析，分别鉴定为香柑内酯（），花椒毒内酯（），亥茅酚（），异紫花前胡内酯（），东莨菪内酯（），香草酸（），d甘露醇（）和蔗糖（），其中与为首次自此植物中提得18。现代药理作用中还未检测出抗病毒作用，但对于免疫具有一定的功效，而病毒对人体的伤害有一部分正是对免疫功能的伤害，也因此，防风此项药理作用，可能与抑制病毒活性有关。通过对配伍处方有效成分有效部位的体外抗病毒研究，考量感冒清热颗粒并不包治感冒19开展此课题，对感冒清热颗粒有效成分及有效部位进行具体分析，寻找抗病毒类药物。在此之前在五味解毒颗粒剂对呼吸道感染作用的实验研究20中感冒清热颗粒作为其阳性对照，作用效果不强，本次研究混合药物有效成分的提取毒性过大，抑毒效果极差，显微镜下观察，药物覆盖于细胞表面，细胞绝大多数中毒死亡，再一次证实了感冒清热颗粒对治疗呼吸道感染作用效果不强。5结论感冒清热颗粒中白芷，葛根，荆芥穗，薄荷，防风，紫苏叶的水溶性成分，具有抑制呼吸道合胞病毒的作用，其中荆芥穗，薄荷效果最明显，有效指数达16；其他极性溶剂提取物抗病毒效果均不明显。因此感冒清热颗粒在抗呼吸道合胞病毒的有效成分、有效部位应该是薄荷及荆芥穗的水溶性成分。参考文献1李宾,吴福玲,冯学斌.呼吸道合胞病毒毛细支气管炎与支气管哮喘的相关性研究j.临床儿科杂志.2012,30(2):116-1192李奇凤,张斌,贾娜尔.住院患儿合胞病毒和腺病毒感染调查j.中国热带医学.2011,(12):92-933吴琳华,樊宏伟.喉咽清制剂的体外抑病毒作用的实验研究j.中国中医药科技.2002,9(5):3204黄慧莲,林涛.优化荆芥穗挥发油提取分离及质控方法j.江西中医学院学报.2011,23(4):31-335王立斌,马永纯.水蒸气蒸馏法提取薄荷中挥发油j.通化师范学院学报.2005,26(6):56-576杨咏洁,权伍荣.紫苏叶挥发油提取工艺的研究j.延边大学农学学报.2009,( 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