一氧化氮介导的呱氨托美汀镇痛作用机理研究

一氧化氮介导的呱氨托美汀镇痛作用机理研究 李元海 张健 李 俊 黄 艳 吕雄文 金 涌 张磊 葛金芳 (安徽医科大学第一附属医院麻醉科 合肥 230022） 摘要 目的 探讨一氧化氮(NO)介导的呱氨托美汀(AMG)镇痛作用机理。方法 利用 AMG 对冰醋酸（AA）扭体疼痛小鼠的镇痛作用；测定其脊髓、脑和血液 的 NO2-，一氧化氮合酶(NOS)含量。L-Arg, L-NAME 对 AMG 在 AA 与福尔马 林（FA）致痛小鼠的镇痛作用；测定 L-Arg, L-NAME 对 AMG 在 AA 扭体镇痛 小鼠脊髓、脑和血液的 NO2-含量。结果 在 AMG 对 AA 扭体致痛小鼠镇痛作用 中， AMG 大剂量（ 300 mgkg-1）组与中剂量（150 mgkg-1）组小鼠脊髓 NO2- 含量和模型组比较显著降低（P0.05） ，但是脑和血液未见显著变化。 AMG+L- Arg 组和 AMG 组比较小鼠 15min 内扭体次数显著增多（P0.05） ；而 AMG +L- NAME 组和 AMG 组比较小鼠 15min 内扭体次数显著下降（P0.05） 。L-Arg, L- NAME 对 AMG 在 AA 扭体致痛小鼠镇痛，AMG（150 mgkg-1）组小鼠脊髓 NO2-含量和模型组比较显著降低（P0.05 ） 。AMG 和 L-NAME 可减少 FA 致痛 小鼠第二时相累计舔足时间。结论 L-Arg 和 L-NAME 可能对 AMG 镇痛作用有 一定影响，AMG 可能通过抑制 NO 的生成发挥脊髓的镇痛作用。 关键词 一氧化氮，呱氨托美汀，镇痛 一氧化氮（nitric oxide, NO）作为细胞间信使分子参与脊髓,脊髓上和外周 三个水平伤害性信息传递过程已被许多学者证实 1，2，3 , 但是 NO 参与痛觉调节 存在着相互矛盾的结果,有些 L-Arg-NO-cGMP 信息传递对外周伤害性感受器有 直接的抑制作用,可产生镇痛作用,但相反的报道 NO 供体, cGMP 类似物对痛敏 有促进作用,一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)抑制剂(如 L-NAME)对它有 抑制 作用 4。呱氨托美汀（Amtolmetin Guacyl ,AMG）是一种新的非甾体抗炎药 (nonsteroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs)，具有抗炎、镇痛、解热作用， AMG 的代谢产物 MED5 和托美汀（Tolmetin,TOL）,也具有抗炎镇痛作用。同 时 AMG 诱导胃粘膜诱生型一氧化氮合酶(iNOS)表达，增加胃粘膜上皮细胞合成、释放 一 氧化氮，保护胃粘膜免受酒精、药物等损害，达到保护胃粘膜的作用 5,6,7,8。探 讨 AMG 是否通过调节脑、脊髓、外周的 NO 水平，发挥镇痛作用，从而对 2 AMG 镇痛作用机理进行一些探索性研究。 1 材料 11 药品 AMG 科隆药业有限公司提供，TOL 科隆药业有限公司提供，羧 甲基纤维素钠（CMC）上海三浦化工有限公司提供。 12 试剂 NOS 试剂盒南京建成生物工程研究所供应。 AA 安徽省蚌埠市皖 达试剂厂生产。FA 广东省汕头市西陇化工厂生产。萘乙烯二胺盐酸盐由中国医 药上海化学试剂公司提供。对氨基苯磺酸由同济大学应用技术研究所提供。5% 磷酸由安徽省铜官山化工总厂生产。生理盐水由安徽丰原药业股份有限公司无 为药厂生产。L-Arg 购于 Sigma 公司，L-NAME 购于 Fluka 公司。 13 动物 体重 1822g 昆明种小鼠，普通级，安徽医科大学实验动物中心 （皖科动物准字 001 号）供应。 2 方法 21 剂量与分组 AMG 对 AA 扭体疼痛小鼠镇痛作用中， 60 只昆明种小鼠、 各半，随机分 6 组，每组 10 只。正常对照（Normal）组（NS 0.2ml，ip） ，模 型 (Model)组（给 CMC） ，TOL 90 mgkg-1 组，AMG 75 mgkg-1 组、AMG150 mgkg-1 组、AMG 300 mgkg -1 组。 L-Arg, L-NAME 对 AMG 在 AA 致痛小鼠镇痛作用，120 只昆明种小鼠、 各半，随机分 12 组，每组 10 只。Normal 组（NS 0.2ml，ip） ，Model 组（给 CMC） ，TOL 90 mgkg-1 组，AMG150 mgkg-1 组，L-Arg75 mgkg-1 组, L- NAME40 mgkg-1 组， TOL 90 mgkg-1+ L-Arg75 mgkg-1 组，TOL 90 mgkg-1+ L-NAME40 mgkg-1 组，TOL 90 mgkg-1+ L-Arg75 mgkg-1 +L-NAME40 mgkg-1 组，AMG150 mgkg-1+ L-Arg75 mgkg-1 组，AMG150 mgkg-1+ L-NAME40 mgkg-1 组，AMG150 mgkg -1+ L-Arg75 mgkg-1+ L-NAME40 mgkg-1 组。 L-Arg, L-NAME 对 AMG 在 FA 致痛小鼠镇痛作用，110 只昆明种小鼠、 各半，随机分 11 组，每组 10 只。Model 组（给 CMC） ，TOL 90 mgkg-1 组， AMG150 mgkg-1 组，L-Arg75 mgkg-1 组, L-NAME40 mgkg-1 组， TOL 90 mgkg-1+ L-Arg75 mgkg-1 组，TOL 90 mgkg-1+ L-NAME40 mgkg-1 组，TOL 90 mgkg-1+ L-Arg75 mgkg-1 +L-NAME40 mgkg-1 组， AMG150 mgkg-1+ L-Arg75 mgkg-1 组，AMG150 mgkg-1+ L-NAME40 mgkg-1 组，AMG150 mgkg-1+ L- Arg75 mgkg-1+ L-NAME40 mgkg-1 组。 22 冰醋酸扭体致痛试验 9 分别 CMC，TOL ，AMG ig60min,和/ 或 sc 射 L- Arg，L-NAME 20min 后,ip 冰醋酸 0.2ml。记录 15min 内小鼠扭体次数,按以下 公式计算抑制率: Model 组扭体次数均数- 受试药组扭体次数均数 3 抑制率 = Model 组扭体次数均数 * 100% 23 福尔马林致痛试验 10，11 分别 CMC，TOL，AMG 灌胃(ig)60min, 和/ 或皮 下（sc ）注射 L-Arg，L-NAME20min 后, 在小鼠右后足底注射 5%FA10l。观 察其舔足反应，并分别在 05min，1530min 二个时相记录小鼠累计舔足时间 （s） 。 2. 4 脑和脊髓匀浆制备 在扭体 20min 后小鼠眼球取血，同时取脑和脊髓称重， 加冷生理盐水，制成 10%的脑和脊髓的组织匀浆，离心(4000g, 10min)取上清， 测 NO2- 和 NOS 的含量。 2. 5 NOS 测定 按 NOS 试剂盒说明书的操作步骤进行。 26 NO2- 含量的测定 参照Prado WA et al 12方法 ，Griess试剂配制，用双 蒸水配制0.1%萘乙烯二胺盐酸盐（NED）一份。用 5%磷酸配制1%对氨基苯磺 酸一份，上述两份试剂试验前等量混匀。取血清、脑脊髓组织上清液100l，加 Griess试剂 100l室温静置10min 后用酶标仪在540nm处测定其吸光度（OD） 。 27 统计学处理 用 SPSS10 统计学软件进行统计学处理，计量资料 xs 表示， 单因素方差分析（ANOVA） ，Tukey 检验差异显著性，P 0.05 表示差异有显著 性。 3 结果 31 AMG 对 AA 致痛小鼠脊髓、脑与血液 NO2-的影响 如表 1 所示 Model 组、TOL 组与 Normal 组比较脊髓和脑组织、血液的 NO2-含量显著上升（P 0.05） ；而 AMG（300,150 mg kg-1）脊髓和血液的 NO2- 含量与 Model 组比较显著降低（P0.05 ） ；AMG（300,150,75 mgkg-1）脑组织 上清液 NO2-含量与 Model 组比较均显著降低（P0.05） ， 32 AMG 对 AA 致痛小鼠脊髓、脑与血液 NOS 的影响 如表 2 所示 Model 组、TOL 组脊髓和脑组织的 NOS 含量与 Normal 组比较 显著升高（P0.01） ，而 AMG（300、150 mgkg-1）均能使脊髓和脑组织的 NOS 含量明显下降。提示 AMG 与 TOL 的镇痛作用机制有所不同， AMG 对 NOS 的抑制作用可能主要在脊髓和脑。 Tab1 The effect of AMG on Spinal cord, brain, blood NO2- concentration in writhing 4 test of mice（ n =10, s）x Groups Dose /mgkg-1 Spinal cord /molmgprot-1 Brain /molmgprot-1 Blood /molL-1 Normal - 5.221.44 9.252.42 15.143.86 Model - 6.931.50* 11.982.19* 18.594.37* TOL 90 6.771.93* 11.572.09* 18.064.52* AMG 75 5.821.77 9.761.15 16.534.06 150 5.521.12 9.102.36 15.573.58 300 5.371.11 8.232.01 15.333.18 *P0.05 vs normal group； P0.05, P0.01 vs model group Tab2 The effect of AMG on spinal cord, brain,blood NOS concentration in writhing test of mice（ n =10, s）x Groups Doses / mgkg-1 Spinal cord /Umgprot-1 Brain /Umgprot-1 Blood /Uml-1 Normal - 8.070.09 2.240.65 21.323.98 Model - 12.363.07* 3.851.24* 23.291.82 TOL 90 11.613.76* 3.331.17* 23.532.58 AMG 75 10.442.81 2.980.91 22.452.58 150 10.322.53 2.480.85 22.123.66 300 9.881.64 2.190.62 22.893.80 *P0.05, *P0.01 vs normal group； P0.05, P0.01 vs model group 33 L-Arg 与 L-NAME 对 AMG 的 AA 致痛小鼠镇痛影响 5 如表 3 所示 AMG+L-Arg 组和 AMG 组比较小鼠 15min 内扭体次数显著增 多（P0.05） ，提示 L-Arg 可能有拮抗作用；而 AMG +L-NAME 组和 AMG 组 比较小鼠 15min 内扭体次数显著下降（P0.05） ，与 L-NAME 具有协同作用有 关，L-Arg 和 L-NAME 可能对 AMG 镇痛作用有一定影响。提示 AMG 的镇痛 作用与 TOL 不完全一样，部分是通过抑制 NO 产生而发挥其镇痛作用。 Tab 3 The effect of L-Arg, L-NAME on the antinociception of AMG in the writhing test of mice （ n =10, s）x Groups n Doses /mgkg-1 Number of writhing /number/ 15min Inhibition rate / % Model 10 - 36.206.89 0.00 TOL 10 90 22.104.75* 38.95 AMG 10 150 23.404.45* 35.36 L-Arg 10 75 37.207.25 -2.76 L-NAME 10 40 28.105.97* 22.38 TOL+L-Arg 10 100+75 23.805.28* 34.25 TOL+L-NAME 10 100+40 20.903.45*, 42.27 TOL+L-Arg+L-NAME 10 100+75+40 20.803.65* 42.54 AMG+L-Arg 10 150+75 28.506.28* 21.27 AMG+L-NAME 10 150+40 18.102.92*# 50.00 AMG+L-Arg+L- NAME 10 150+75+40 23.604.91*, 34.81 *P0.05, *P0.01；vs model group; P0.05, AMG vs AMG+L-Arg; #P0.05 AMG vs AMG +L-NAME 34 L-Arg 与 L-NAME 对 AMG 镇痛小鼠脊髓、脑和血液 NO2-影响 在 L-Arg，L-NAME 对 AMG 在 AA 致痛小鼠镇痛作用中， Model 组脊髓和 脑组织上清液、血液 NO2-含量与 Normal 组比较均明显升高（ P0.05， P0.01） 。而 AMG，L-NAME，AMG+L-NAME 组脊髓和脑组织上清液 NO2-含 量与 model 组比较显著下降（P0.05， P0.01） ，L-Arg，AMG+L-Arg+L- 6 NAME 脊髓组织上清液 NO2-含量与 AMG 组比较有显著上升（ P0.01） ，进一 步提示 AMG 镇痛作用可能与抑制脊髓和脑组织释放 NO 有关，结果如表 4 所 示。 Tab4 The effect of L-Arg,L-NAME on the spinal cord NO2- concentration of AMG antinociception in the writhing test of mice （n =10, s）x Groups Dose /mgkg-1 Spinal cord /molmgprot-1 Brain /molmgprot-1 Blood /molL-1 Normal - 4.641.82 3.730.97 14.644.29 Model - 6.642.02* 6.242.13* 17.104.53* TOL 90 5.992.32 5.220.53 17.455.51 AMG 150 5.161.13 4.060.76 16.062.20 L-Arg 75 9.792.81 7.931.19 20.203.57 L-NAME 40 4.861.66 4.031.08 17.924.22 TOL+L-Arg 90+75 6.482.24 5.571.71 19.793.85 TOL+L-NAME 90+40 5.791.34 4.651.43 18.947.98 TOL+L-Arg+L-NAME 90+75+40 5.631.73 5.132.32 18.167.37 AMG+L-Arg 150+75 7.532.49 5.851.49 19.386.73 AMG+L-NAME 150+40 4.611.47 4.030.82 15.675.78 AMG+L-Arg+LNAME 150+75+40 7.363.37 6.610.90 18.213.77 *P0.05, *P0.01 model group vs normal group; P0.05, P0.01 vs model group; P0.05 P0.01 vs AMG group 35 L-Arg 与 L-NAME 对 AMG 的 FA 致痛小鼠镇痛影响 如表 5 所示，无论是 TOL 还是 AMG 各给药组对 FA 诱导第一时相小鼠舔 足时间均无明显影响。而在 FA 诱导的第二时相，TOL 与 AMG 均对第二时相 小鼠累计舔足时间有明显的抑制作用，而 L-Arg 与 AMG 联合应用则明显增加 第二时相小鼠累计舔足时间，AMG 与 L-NAME 联用则可以逆转上述现象，L- Arg 与 TOL 联合应用对小鼠累计舔足时间却无明显影响。提示 AMG 的镇痛作 7 用与调控中枢与外周的 NO 或 NOS 有关。 Tab 5 The effect of L-Arg, L-NAME on the antinociception of AMG in the formalin test of mice（ n =10, s）x Group n Dose mgkg-1 Total paw-licking time /s First phase (0-5min) Second phase (15-30min) Model 10 - 27.765.28 166.7825.67 TOL 10 90 27.405.86 65.0515.94* AMG 10 150 26.606.51 63.0714.39* L-Arg 10 75 27.585.76 194.1325.91 L-NAME 10 40 25.885.98 135.4825.44* TOL+L-Arg 10 100+75 26.736.52 72.2615.72* TOL+L-NAME 10 100+40 26.528.17 60.4014.99* TOL+L-Arg+L-NAME 10 100+75+40 27.038.87 64.0912.49* AMG+L-Arg 10 150+75 25.565.65 130.0316.73* AMG+L-NAME 10 150+40 28.175.85 42.6911.56* AMG+L-Arg+L- NAME 10 150+75+40 26.317.24 65.0015.59*# *P0.05, *P0.01 vs model； P0.05, P0.05 vs AMG； #P0.05 AMG+L- NAME vs AMG+L-Arg+L-NAME 4 讨论 一氧化氮（nitric oxide NO）是小分子量的生物活性气体分子，可自由通过 神经元细胞膜，半衰期只有数秒（3-5 秒） 。催化 NO 生物合成的酶称为一氧化 氮合酶（nitric oxide synthase, NOS） ，NOS 以 L-精氨酸（L-Arg）和分子氧为底 物，反应生成 NO 和 L-瓜氨酸。目前认为 NO 在脑、脊髓、外周多个层面调控 疼痛，在不同浓度具有镇痛、致痛、甚至致瘫作用 13。 鞘内注射（it）NO 供体 3-morpholinosydnonimine(SIN-1)0.1-2.0g/10l 降 低大鼠坐骨神经结扎所致痛敏产生镇痛作用。而 SIN 10 和 20ug/10ul 可能增加 其痛敏，产生致痛作用，SIN 5 或 100g/10l 不产生镇痛和痛敏作用。鞘内注 8 射 SIN 0.1-100g/10l 只对大鼠的缩尾试验具有镇痛作用，因此随着剂量和动 物模型的不同，NO 可能具有镇痛、致痛双向调节作用 4。进一步研究表明， NO 前体（如 L-Arg）随着剂量增加 10-100mg/kg 具有剂量依赖性致痛-镇痛-致 痛三相模式，而 NOS 抑制剂（如 L-NAME） 18.75-150mg/kg 具有镇痛作用 14。 呱氨托美汀的化学名称：2-甲氧基苯酯，1-甲基-5（p-甲苯甲酯吡咯） ，2- 乙酰胺乙酸酯(2-methoxyphenyl 1-methyl-5p-methlbenzoyl pyrrole-2-acetamide acetate, MED15，ST679) ， AMG 及其代谢产物 MED5 和 TOL 的化学结构式 （如图 1） 。呱氨托美汀是一种新的非甾体抗炎药，具有抗炎、镇痛、解热作用。 非选择性抑制环氧化酶（COX） ，减少前列腺素释放，发挥抗炎、镇痛作用 5。 AMG 通过增加胃粘膜上皮细胞一氧化氮合酶（NOS）的活性，促进其释放一氧 化氮（NO） ，不但降低 AMG 对胃粘膜的损伤，而且对乙醇诱导的胃粘膜损伤 有保护作用 5，6 ，这是托美汀等其他非甾体抗炎药不具备的优点。临床试验研 究表明呱氨托美汀对急性疼痛、术后疼痛等具有较强的镇痛作用 15，16 。 从上述化学结构式可知，AMG 在降解成 TOL 的同时释放呱氨基团，而 NOS 以 L-精氨酸（L-Arg ）和分子氧为底物，反应生成 NO 和 L-瓜氨酸。AMG 是否通过其释放的呱氨基团反馈性抑制 NO 的生成，过去的研究未见报道。本 实验结果表明 AMG 大、中 2 个剂量组对 AA 致痛模型小鼠脊髓 NO 含量有明 显抑制作用,但是其 NOS 含量未见明显下降。进一步说明 AMG 不是通过抑制 NOS 表达而抑制 NO 合成,而是可能通过其生成呱氨基团竞争性抑制 L-瓜氨酸 的生成，