“创新实验”顺铂和阿霉素的浓度对细胞增殖产生的影响

创新实验论文 探究抗肿瘤药物顺铂和阿霉素的浓度对人宫颈癌细胞 HeLa细胞增殖和凋亡产生的影响 姓名：胡尔曼那力艾力胡加 学号：201111202924 年级：2011 级 专业：生物科学 探究抗肿瘤药物顺铂和阿霉素的浓度对人宫颈癌细胞 HeLa细胞增殖和凋亡产生的影响 摘要：本实验主要探究抗肿瘤药物顺铂和阿霉素对 HeLa 细胞增殖及 凋亡的影响，HeLa 细胞是一种癌细胞，增殖速度快，通过探究其药 物的浓度对癌细胞的抑制及其凋亡情况，可以利用药物有效地控制 细胞的增殖并使细胞致死。通过 MTT 比色法对 HeLa 细胞进行生长 曲线的测定，观察细胞的生长情况。在生长曲线上找出相应的 IC50 的值，并且比较不同浓度下的 IC50 的值，即可知道药物的浓度对细 胞增殖所造成的影响。通过流式细胞术实验方法测出细胞的凋亡比 例及各个周期时相的百分比即可知道不同药物对于 HeLa 细胞凋亡的 影响。 前言：细胞增殖是生物体的重要生命特征，细胞以细胞分裂的方式 进行增殖。通过细胞分裂，可以将复制的遗传物质，平均地分配到 两个子细胞中去。可见，细胞增殖是生物体生长、发育、繁殖和遗 传的基础。细胞如果增殖异常如无限地增殖，将会导致生物体的正 常生命功能受阻，如肿瘤的发生。细胞死亡也是生物体的重要生命 活动之一。多细胞生物发育过程中，在细胞增殖和分化的同时一些 细胞被选择性地消除，以形成组织、器官和四肢，而且在整个生命 进程中，细胞的死亡与新细胞的产生之间的动态平衡对于维持组织 和器官的正常功能具有重要作用。因此，细胞死亡调控的异常与帕 金森症、自身免疫性疾和癌症等疾病的发生和发展密切相关。 癌症是威胁人类健康的最严重的疾病之一，并呈不断上升趋势。 目前用于癌症治疗的主要手段有手术、放疗、化疗和生物治疗。肿 瘤化学治疗是应用一种或数种化学药物，通过口服或注射达到治疗 肿瘤的方法。不同肿瘤的化疗效果差别很大，手术前后的合理化疗， 有助于提高疗效。目前发现许多天然药物具有抗肿瘤作用。其中很 多抗肿瘤药物可以明显抑制肿瘤细胞的增殖，而对正常细胞的毒副 作用较小。如顺铂、阿霉素、喜树碱、顺铂、阿糖胞苷、放线菌酮、 环磷酰胺。这些药物均可以抑制肿瘤细胞的增殖，并且目前有不错 的效果。 关键词：顺铂 阿霉素 HeLa 细胞 细胞增殖 细胞凋亡 1 实验原理 1.1 HeLa 细胞 HeLa 细胞是源自一名美国妇女的子宫颈癌细胞的细胞。H eLa 细 胞 株 是 由 正 常 子 宫 颈 细 胞 被 一 种 人 类 乳 突 状 瘤 病 毒 （ Human Papillomavirus 18 或 HPV18） 转 型 成 癌 细 胞 的 HeLa 细胞至今已被视为“不死的” ，也就是说此细胞 株（不同于其他人类细胞）不会老死，而且可以不限次数的分裂下去，而且已 培养出一个不间断的系列。从 1951 年至今，HeLa 细胞已经培养了 50 多年，分 裂了 18000 次以上仍然没有停止的迹象。此细胞株即使和其他癌细胞相比，增 殖依然异常迅速。 1.2 顺铂和阿霉素 顺铂（顺氯氨铂，cisplatin,DDP ） 将所含之氯解离，然后与 DNA 上的核碱鸟嘌呤、腺嘌呤和胞嘧啶形成 DNA 单链内两点的交叉联结，也可能形成双链间的交叉联结，从而破坏 DNA 的 结构和功能。对 RNA 和蛋白质合品属细胞周期非特异性药物，具有细胞毒 性，可抑制癌细胞的 DNA 复制过程，并损伤其细胞膜上结构，有较强的广 谱抗癌作用。临床用于卵巢癌、癌前列腺癌、睾丸癌、肺癌、鼻咽癌、食道 癌、恶性淋巴瘤、头颈部鳞癌、甲状腺癌及成骨肉瘤等多种实体肿瘤均能显 示疗效。成的抑制作用较弱。属周期非特异性药物。 阿霉素是一种抗肿瘤抗生素，通过抑制癌细胞遗传物质核酸的合成来杀灭癌细 胞。盐酸阿霉素对机体产生广泛的生物化学效应。具有强烈的细胞毒性作用。 其作用机制主要是阿霉分子嵌入 DNA 而抑制核酸的合成。 1.3 PI 和 Ho.33342 PI（碘化丙啶）：双链核酸标记物，亲水性，不能通过完整细胞膜，激发光谱 和发射光谱分别为 535nm 和 617nm，激发光波长范围较宽，从紫光到绿光均可 作为激发光。 Ho.33342：特异结合 AT 区的 DNA 标记物，亲脂性，激发光谱和发射光谱分别 为 350nm 和 461nm 细胞类型 膜完整性 染色质凝集程 度 凋亡小体的形 成 PI 染色 Ho.33342 正常细胞 完整 不凝集 无 无法透过 蓝色 凋亡细胞 完整 高度凝集 有 无法透过 蓝色 坏死细胞 破损 一定程度的凝 集 无 橘红色 蓝色（同时染 PI 被橘红色遮掩） 1.4 MTT 比色法 MTT 比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒 体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒 （Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶 解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在 490nm 波长处测定其光吸收值，可间接 反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT 结晶形成的量与细胞数成正比。 1.5 IC50 IC50是指细胞被抑制一半时抑制剂的浓度，这里的反应可以是酶催化反应， 抗原抗体反应等。在凋亡方面，可以理解为一定浓度的某种药物诱导肿瘤细胞 凋亡 50%，该浓度称为 50%抑制浓度，即凋亡细胞与全部细胞数之比等于 50% 时所对应的浓度，IC50 值可以用来衡量药物诱导凋亡的能力，即诱导能力越强， 该数值越低，当然也可以反向说明某种细胞对药物的耐受程度。 2 .实验步骤 2.1 利用 MTT 法检测细胞增殖 1、 取对数生长期的细胞,用胰酶消化计数, 配制细胞悬液浓度为 4x104/mL， 取细胞接种到 96 孔板，每孔 200L，8000 细胞/孔。 2 、加药处理: （1）24 小时后，待细胞贴壁后吸取培养基 200L ，弃除，调零孔 不作处理。 （2）设置药物浓度分别为 1x10-3g/ L、2x10 -3g/ L 、4x10 - 3g/ L、6x10 -3g/L、 8x10-3g/L,对应按每列分别加入 Cc1、C2、C4、C6 、C8(顺铂组) ，Cd1 、D2 、D4、D6、D8（阿霉素组）列 中。96 孔板上药物分布如表 1 所示： （3）配置浓度梯度及加药方法： 药物母液浓度为 5mg/mL，即 5g/L，顺铂溶于 DMSO，盐酸 阿霉素溶于水。分别取 0.4mL 顺铂/阿霉素，加入 1.6mLDMSO/水，混合 均匀，得到 1g/L 的顺铂及阿霉素溶液。顺铂与阿霉素的浓度梯度配 置方法相同。 取药物 2/4/8/12/16L, 对应加入 14/12/8/4/0LDMSO/ 水（药物 为顺铂即加 DMSO，药物为阿霉素即加水） ，各加入 2mL 培养基，即配制 出浓度分别为为 1x10-3g/L、2x10-3g/L、4x10- 3 g/ L、6x10-3g/ L、8x10-3g/L 的药物。两种药物不同浓度 分别相应加入 Cc1、C2、C4、C6、C8(顺铂组) ， Cd1、D2、D4 、D6 、D8 （阿霉素组）列中，每孔 200L。 取培养基 2mL，分别加入 16LDMSO/ 水，混合均匀，加入到对照 1/对 照 2 列中，每孔 200L。 3 、测定: 取测定孔, 弃去培养基 ,加 100 L 新鲜的培养基, 加 12 L MTT，4 小时后加 100 L 裂解液。过夜后，用酶标仪测定 OD 值。 4 、根据测得 OD 值，用 SPSS 软件进行分析，求出以对照组吸光度 OD 值减少一半所需的药物浓度 IC50，即半数抑制浓度。 2.2 细胞的形态学观察 1 、取生长到 80-90%融汇度，对数生长期的细胞，按 1：4 比例传代。 取 1 瓶细胞传到 4 瓶 。 2、按求得的顺铂及阿霉素浓度在传代的第二天，向培养基中加入药物或 对照溶液。弃除细胞培养瓶中原培养液，加入 5mL 新培养基。分别取浓 度为 5mg/mL 的顺铂及阿霉素母液，其中顺铂 7L，阿霉素 4L 各加入 细胞培养瓶中。对照组分别取 DMSO7L，水 L 各加入细胞培养瓶中。 3、 48-72 小时后，收集培养液，用胰酶适度消化细胞， 用收集的培液吹打细 胞，将分散成单个的细胞悬液收集至 10mL 离心管中， 1000rpm, 离心 15 min 去上清，用 0.2 毫升 PBS 重悬细胞 4、取 200 l PBS 细胞悬液，加入 PI 20 L （终浓度 100 g/ml ） ， Ho.33342 2L（终浓度 10g/ml） ，混匀，37 度温箱中避光标记 15min。(带手套操作） 5、 1000rpm，离心 10min，弃上清，加 10-50 L PBS 重悬，取 10 L 滴于载玻片上，盖片（不能有气泡或漂起） ，保存于暗处。 6、荧光显微镜观察拍照（紫外激发） 。 3实验结果 3.1MTT 法实验结果 顺铂的实验结果： 分析： 由 MTT 实验结果可看出，可能会出现波动较大的数据，计算 IC50 时应 将这些数据舍去。根据所测 OD 值可算出顺铂对 BGC-823 细胞的 IC50 值 为 5.698 左右。但数值波动较大，实验结果不稳定，综合全班实验可知 顺铂的添加浓度约为 7。 阿霉素的实验结果 分析： 由 MTT 实验结果可看出，可能会出现波动较大的数据，计算 IC50 时应将这些数 据舍去。根据所测 OD 值可算出顺铂对 BGC-823 细胞的 IC50 值为 3.054 左右。 但数值波动较大，实验结果不稳定，综合全班实验可知顺铂的添加浓度约为 4。 3.2 顺铂和阿霉素对人宫颈癌细胞 HeLa 细胞凋亡的影响的形态学 观察 图一为 Ho.333422 和 PI 染料双染 HeLa 细胞得到的细胞核形态图。从图 中观察可以看到有呈蓝色的细胞，也有呈红色的细胞。图一中的 A、B 代表未加顺铂和阿霉素的空白对照。C 为加入顺铂的 HeLa 细胞的细胞 核形态图，D 为加入阿霉素的 HeLa 细胞的细胞核形态图。 A B C D 图一 Ho.333422-PI 双染观察凋亡细胞的形态 从图一中可以看出，对照组 A、B 的细胞数目要明显多于实验组 C、D 的细 胞数目。C 、 D 实验组加入了顺铂和阿霉素，由此说明顺铂和阿霉素确实对 于细胞的生长具有抑制作用。当比较 A、C 两组的时候发现，对照组基本上 没有出现凋亡细胞；分别观察两个视野可以发现，加药组出现了部分凋亡 细胞。从细胞凋亡形态观察结果可看到，视野中的坏死细胞较多，可能因 为实验操作不够轻柔，从而导致细胞坏死；也可能是在用胰酶消化细胞消 化过度而引起的细胞坏死。因此实验时要注意以上两点。当 BD 两组相比较 可发现对照组基本上没有出现凋亡细胞；分别观察两个视野可以发现，加 药组出现了部分凋亡细胞（一个视野中有 4 个，另一个视野中有 2 个） 。从 细胞凋亡形态观察结果可看到，视野中有少量坏死细胞，可能因为实验操 作不够轻柔，从而导致细胞坏死；也可能是在用胰酶消化细胞消化过度而 引起的细胞坏死。因此实验时要注意以上两点。有上述的比较还可以知道， 顺铂和阿霉素可以促进细胞的凋亡。 4.实验总结 综合上面所述的三个结果分析，顺铂和阿霉素都对 HeLa 细胞的