【毕业学位论文】（Word原稿）养猪发酵床垫料微生物群落动态及其对猪细菌病原生防作用的研究

分类号： 单位代码： 10389 密 级： 学 号： 士学位论文 养猪发酵床垫料微生物群落动态及其对猪细菌病原生防 作用 的研究 学 科 门 类： 农学 一级学科名称： 植物保护 二级学科名称： 农药学 研 究 方 向： 环境微生物 研 究 生： 指 导 教 师 ： 教授 研究员 研究员 完 成 时 间： 二 O 一一 年四月 s of on 2011 独创性声明 本人声明，所呈交的学位（毕业）论文，是本人在指导教师的指导下独立完成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位（毕业）论文作者亲笔签名： 日期： 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位（毕业）论文的规定，即学校有权送交论文的复印件 ，允许论文被查阅和借阅 ; 学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在 年后解密可适用本授权书。 不保密，本论文属于不保密。 学位（毕业）论文作者亲笔签名： 日期： 指导教师亲笔签名： 日期： 福建农林大学硕士学位论文 i 目录 中文摘要 . I . 一章 绪 论 . 1 1 畜禽养殖污染现状 . 1 2 猪常见细菌性病害 . 2 猪大肠杆菌病 . 2 猪沙门氏菌病 . 3 猪链球菌病 . 3 巴氏杆菌病 . 4 猪副嗜血杆菌病 . 4 其他细菌性病害 . 4 3 微生物发酵床养猪技术简介 . 5 4 脂肪酸生物标记在微生物群落研究中的应用 . 6 5 本研究的目的及意义 . 7 第二章 养猪发酵床垫料微生物组成结构的变化 . 8 1 引言 . 8 2 材料与方法 . 8 养基和试剂 . 8 品采集与处理： . 8 生物的分离与培养： . 8 料中各种微生物的数量计算方法： . 9 3 结果与分析 . 9 生物发酵床细菌数量变化 . 9 生物发酵床真菌数量变化 . 9 生物发酵床放线菌数量变化 . 10 4 讨论 . 10 第三章 养猪发酵床垫料 微生物群落多样性 . 12 1 引言 . 12 2 材料与方法 . 12 试菌株 . 12 养基和试剂 . 12 株的 取 . 12 福建农林大学硕士学位论文 定 . 12 6S 列分析 . 13 3 结果与分析 . 13 质垫层细菌的 16s 定 . 13 同使用时间基质垫层可培养细菌多样性变化 . 15 4 讨论 . 18 第四章 养猪发酵床垫料微生物脂肪酸生态学特性 . 20 1 引言 . 20 2 材料与方法 . 20 本采集与保存 . 20 肪酸提取试剂 . 20 肪酸鉴定仪器 . 21 肪酸提取步骤 . 21 测 . 21 据分析 . 21 3 结果与分析 . 22 生物脂肪酸生物标记总量的变化动态 . 22 生物脂肪酸生物标记在基质垫层中的分布 . 23 质垫层微生物脂肪酸生物标记的分布特性 . 23 质垫层 物标记多样性分析 . 32 4 讨论 . 33 第五章 微生物发酵床垫料猪细菌病原种群动态 . 35 1 引言 . 35 2 材料与方法 . 35 养基和试剂 . 35 品采集与处理： . 35 肠杆菌和沙门氏菌的分离与培养： . 35 料中大肠杆菌和沙门氏菌数量的计算方法： . 36 肠杆菌和沙门氏菌的特异性检测 . 36 3 结果与分析 . 37 生物发酵床中大肠杆菌特异性检测及其时空分布动态 . 37 生物发酵床中沙门氏菌菌群特异性检测及其时空分布动态 . 38 生物发酵床微生物群落与猪病原菌相关性分析 . 39 质垫层磷脂脂肪酸（ 物标记和病原菌数量的相关性分析： . 40 4 讨论 . 41 第六章 养猪发酵床垫料细菌优势种及其对猪细菌病原抑制作用 . 43 福建农林大学硕士学位论文 引言 . 43 2 材料与方法 . 43 试菌株与培养基 . 43 种活化： . 43 菌圈法测定： . 44 势种的确定 . 44 3 结果与分析 . 44 生物发酵床细菌优势种的确定 . 44 生物发酵床细 菌对靶标大肠杆菌和沙门氏菌的抑制效应 . 46 4 讨论 . 48 第七章 结论与展望 . 50 1 结论 . 50 2 展望 . 51 参考文献 . 52 福建农林大学硕士学位论文 I 摘要 生猪疫病一直是困扰养猪业的一道难题，猪舍的不良环境是许多疾病的诱因，只有给猪提供舒适、干净的生活环境才能减少生猪疫病的发生，提高生猪的生产能力。微生物发酵床养猪作为近年我 国引进的一种新兴养猪模式，实现了养猪无臭味，零排放的目的。利用发酵床养猪最大的好处是给猪在其生态环境中创造了一道益生菌抵抗有害菌的天然防线，提高了动物的免疫水平，大大降低了发病率、死亡率。 本研究采用平板分离法和磷脂脂肪酸（ 对微生物发酵床养猪猪舍基质垫层微生物群落结构多样性 、 病原菌分布动态进行研究 ，结果如下 ：（ 1） 通过系统调查发现，发酵床猪舍基质垫层中含有丰富的微生物种群，从基质垫层中分离的细菌经鉴定，属于 22 个 不同 属。（ 2） 微生物发酵床中细菌是优势菌，分布数量达到了 108 数量级，其群落动态呈 现先上升后下降的趋势， 而 真菌和放线菌的 分布 数量相对于细菌低 3 4个数量级。 （ 3） 基质垫层有一定量大肠杆菌和沙门氏菌分布， 但是垫料使用一段时间后，其分布数量呈现不断下降趋势，至第 5 个月，降至一个极低的水平。 大肠杆菌 分布数量 与细菌 呈现 显著负相关（ r=与放线菌显著正相关（ r=沙门氏菌 分布数量 与细菌 呈 显著负相关（ r=与真菌（ r=放线菌（ r=显著正相关。（ 4）发酵床技术使用的 先导 菌短短芽孢杆菌（ 基质垫料中 以优势 菌 稳定存在， 并 对大肠杆菌和沙门氏菌有明显的抑制作用。通过抑菌圈实验发现，基质垫层 有些 细菌对大肠杆菌和沙门氏菌有明显的抑制作用，能有效抑制病原微生物的生长。其中发酵床基质垫料 中的 芽孢杆菌属细菌对生猪疫病防治中 起 主要作用。 （ 5）采用磷脂脂肪酸（ ，分析不同使用时间 发酵床基质垫层微生物群落 结构的动态变化 ， 结果从不同使用时间 发酵床基质垫层共检测出了 41 个脂肪酸生物标记， 表明 基质垫层中含有大量 不同 的微生物 类型；分析 垫料使用过程中 多样性 指数变化 ，发现各多样性指数变化 不大， 表明发酵床垫料 群落结构相对稳定。 关键词：微生物发酵床；细菌性病害；微生物群落；磷脂脂肪酸；生物防治 福建农林大学硕士学位论文 he a a in a It of of by a a of in to a to of In of of in of as (1) As in (2)of in at a 108 g of 103 104 g. 22 (3) in a of of to at a It (4) as a be in as to . . by . . It . an in (5) of in of 1 a in it of of 福建农林大学硕士学位论文 1 第一章 绪 论 随着 畜牧业生产规模日益扩大 ，我国以集约化 和 规模化为主的畜禽养猪业得到 了 迅猛发展，为提高城乡居民 的 生活水平 作 出了巨大贡 献， 但是 与此同时养猪业也成为农村面源污染的主要来源之一，破坏了生态环境，严重阻碍了养猪业的发展 1。 近几年 ， 从日本引进并迅速在中国改进、推广、应用的微生物发酵床养猪技术取得了很大的成效。该技术主要借助于养猪垫料中 先导 微生物 （粪污降解菌） 的作用， 利用先导微生物启动垫料发酵，形成以先导菌为优势菌的微生物群落结构， 达到降解畜禽排泄物，减少了污染的目的。许多研究表明 2发酵床养猪与传统的养猪模式相比， 可以在 很大程度上改善 猪的生活环境，猪疾病的发生情况明显降低，死亡率下降 。 1 畜禽养殖污染现状 随着畜牧 业规模化生产的不断发展，不可避免地 会 对周围 的 环境 造成 污染。畜产废弃物中 的 粪便及污水 的 数量最大，如 果 不经处理随意 地 向周边排放，不仅 仅 危害家畜本身，对周围环境的 空气、 水体、土壤和作物造成严重 的 污染，还 将 会成为 寄生虫 、 畜禽传染病 和人畜共患病的传染源。因此解决养猪业 中 的粪污排放问题对我国农业经济的可持续发展有着重 要 的意义。畜牧生产对周围环境 造成 的污染主要包括以下几个方面： （ 1）恶臭气体污染： 养殖场恶臭除 了 畜禽的 呼出气体、 皮肤分泌物、外激素等特有的 臭气外，还有来自 粪便 在堆放过程中有机物的腐败分解所产生的 硫化物、 氨气 、吲哚等 200 多种恶臭物质。这些恶臭物质会 对人的神经系统产生刺激 ，对呼吸中枢产生毒害，使人感到 恶心、 头痛，严重影响人们生活 的 质量，同时也 会 影响到畜禽的健康生长。 在这些恶臭气体中，影响最为严重的是硫化氢和氨气。当硫化氢浓度达到 200 300 时，会引起畜禽轻度中毒；氨气浓度达到 50 时，仔猪的增重率下降 12%，达到 100150 时，增重率下降 30%5。 （ 2）病原微生物污染：畜禽体内的微生物主要通过 其 消化道排出体外，粪便为 其 主要载体。病猪和带菌猪的粪便中含有 细菌、病毒、 寄生虫，这 些病原微生物在粪便中 的感染性可以维持 很长时间。同时，由养殖场排出的大量粉尘 中 携带着 数量 和种类众多的微生物，为微生物提供营养和庇护，大大增强了微生物的活力 、 延长 了其生存 的 时间，这些尘埃和微生物可 以 随风传播，从而扩大了污染和危害范围。这些病原微生物如 果 不适当处理， 将 会成为危险的传染源，造成疫病 的 传播，不仅影响畜禽健康生长， 同事 也会威胁 到 人体健康。 （ 3）药物、添加剂污染：在饲料中添加抗生素等药物可以提高畜禽的生产力和抗病力 。 因此，养殖场中普遍采用抗生素来 预防 畜禽疾病。但 由于 长期盲目地 在 饲料中添加抗生素等药物 ， 引 起畜禽体内 的 残留，蓄积， 并 通过生物链进入人体，长期积累在人体内会产生毒副作用，危害人体的健康。有些 抗生素 及 化学药物 残留如 链霉素 、 青霉素 以福建农林大学硕士学位论文 2 及新生霉素 等 会使人发生过敏反应甚至更 为 严重的后果。有些农药、治疗用化学药品和霉菌素等通过畜禽产品的残留形式转移到人体，逐渐在人体中积累、浓缩、损害组织、甚至导致癌变。 （ 4）金属元素污染：在饲料中添加一些可以调节动物代谢的元素，如 锌 、 铜 、铁、砷等微量元素， 可以 在 一定程度上增强畜禽 的 抗病能力，提高畜禽的生长性能，但这些元素被畜禽直接吸收利用的很少，更多是通过粪便 而 排出体外。这 些含在畜禽粪便中的金属元素如 果 不合理处理 的话 ， 将 会造成严重的后果，一旦 污染 土壤，作物在污染的土壤中生长时，有害元素被作物大量吸收后会残留在农产品中，通过食物链进入动物或人体，对人体健康造成威胁。 （ 5）氮、磷污染：畜禽粪便中含有大量的无机态氮、磷和氮、磷化合物。据报道，猪大约将 食入氮和 食入磷排出体外 6，畜禽粪便中的氮、磷可以转化成硝酸盐和磷酸盐，并通过 雨水冲刷 或 下渗 流入河流湖泊，造成 地表水源 和 地下水源 的 污染，造成水体的富营养化，使藻类 及 其他水生植物大量繁殖，这些水生植物 消耗 水体中的溶解氧，导致水生动物缺氧死亡，死亡的水生动物腐烂后，会进一步加剧水体恶化。在我国一些地方，饮用水中 含量高达 300 ，超过饮用水 小于 50 的国际标准，医学研究表明，引用水中 含量超过 90 将会危及人体健康 7。 2 猪常见细菌性病害 近年来，在规模化猪场中，猪细菌病的危害愈加严重，在一些免疫抑制疾病发生的地区尤为常见。中国工程院院士陈焕春教授指出当前规模猪场病毒病趋向缓和 ， 而细菌病则呈上升态势 8。其中链球菌、大肠杆菌、巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌为 4种主要细菌 病。 大肠杆菌病 大肠杆菌（ 1885年由 直被认为是人和动物肠道内的正常菌群的主要成员之一，直到 20世纪中叶，人们才认识到一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物有病原性，尤其 容易 引起婴儿和幼畜的严重腹泻和败血症。 1955年， 大肠杆菌对环境的抵抗力不强， 60 15 其灭活 ，一般的消毒药品都易将其杀死。大肠杆菌有 体抗原）、 面抗原）和 毛抗原）三种。 ，属于磷脂、多糖和蛋白质的复合物，也就是菌体内毒素，耐热。 多数都为包膜物质，也有一些为菌毛，如 起仔猪黄痢的大肠杆菌菌毛，最常见的是 有鞭毛的菌株中存在，与致病性无关。致病性大肠杆菌与大量存在于肠道内的非致病性大肠杆菌，在形态、染色、培养特性和生化反应等反面并无差别，但在抗原构造上有所不同。 猪大肠杆菌病（ 由致病性大肠杆菌引起猪肠道传染病，主要表现为仔猪黄痢（ 仔猪白痢（ 仔猪水肿病（ of 种 9。仔猪黄痢多发生于 1周龄以内的哺乳仔猪，尤其是福建农林大学硕士学位论文 3 1 3日龄仔猪。通常一头仔猪发病，很快会传至整窝，死亡率极高。一年四季均有发生。仔猪白痢主要引起 10 30日龄仔猪非败血性、急性肠道传染病，影响仔猪生长发育。 1020日龄发病最多。一年四季均可发生，严冬、炎热及阴雨连绵季节发病较多。仔猪白痢和仔猪黄痢称为仔猪腹泻性大肠杆菌病。仔猪水肿病是由致病性大肠杆菌引起的一种 急性、散发性肠毒血症。该病的发病率不高，但病死率很高，常出现内毒素中毒的休克症状并迅速死亡。通常由带菌母猪传给仔猪，呈