2012cb518600 基于微血管病变性疾病的营卫“由络以通、交会生化”研究

项目名称： 基于微血管病变性疾病的营卫“由络以 通、交会生化”研究 首席科学家： 吴以岭 河北以岭医药研究院有限公司 起止年限： 2012.1-2016.8 依托部门： 国家中医药管理局 河北省科技厅 一、关键科学问题及研究内容 1.拟解决的关键科学问题 阐明营卫“由 络以通、交会生化”异常与微血管物质能量信息紊乱相关性， 揭示 AMI 无再流、急性脑 梗死、 DN 异病同治的共性病理机制， 阐明心血管事件 链级联反应的微血管内在机制， 寻求微血管病变性疾病异病同治及阻断心血管 事件链的有效治疗新途径， 创新发展脉络学说的营卫“ 由络以通、交会生化”理论。 2.主要研究内容 2.1 营卫“由络以通、交会生化”异常与“孙络-微血管”物质- 能量-信息 网络紊乱相关性及微观病理特征研究 深入研究营卫“ 由络以通、交会生化”异常，阐明以微血管 EC 为核心和启动 因素、神经体液调节与血液 细胞共同参与、脏腑组织细胞功能结构损伤、多 维时 空动态演变的“ 孙络-微血管” 物质-能量-信息紊乱的复 杂 病理过程，为阐明微血管 病变性重大疾病的共性机制与级联反应的内在机制、 寻 找有效干预策略和治疗 方药提供实验数据支持。 既往研究通过临床 3469 例血管病变患者临床调查总结出的脉络病变八类临 床证候类型，本 项目借助现 代实验条件，深入探讨脉 络 病变辨证论治中临床证候 类型脉络瘀阻、脉络绌急、脉 络瘀塞、络息成积的 “孙络微血管”微观病理特征： 孙络瘀阻（微血栓、栓塞、组织水肿压迫管腔狭窄、 闭塞等）、孙络绌急（微血管痉 挛）、孙络 疏失（缺血组织微血管密度降低、数目减少及微血管 EC 凋亡、紧密连 接破坏,通透性异常增加等）、 孙络滋生（易损斑块中病理性血管新生等）。 2.2 探讨微血管病变损伤心脑肾导致 AMI 无再流、急性脑梗死、DN 异病同治的共性病理机制 围绕“心肌灌注 单元” 新概念，阐明微血管 EC 损伤及神 经体液调节异常在 AMI 无再流和再灌注损伤中的核心机制。以脑微血管结构功能与血脑屏障相关 性及其与脑组织细胞相互作用关系为核心，观察脑梗死不同阶段脑影像学动态 演变规律，揭示既往提出的 “缺血区微血管保护脑 梗死治疗新靶点”的科学内涵。 揭示 DN 细胞外基质增生、间质纤维化、足 细胞损伤 的微血管发病机制为通络 干预的异病同治提供实验数据及理论支持。 2.3 揭示易损斑块、AMI、心律失常、心力衰竭心血管事件链微血管 病变的内在机制 以 VEGF 为靶点，探讨动脉硬化斑块病理性血管滋生及淋巴管与斑块易损 性的相关机制。揭示 AMI 心肌缺血对电重构、 结构重构、神经重构等导致心律失 常的发病机制。揭示心肌微循 环障碍、能量代 谢障碍、神经体液调节异常在心力 衰竭中的作用，阐明微血管和心肌细胞之间的物质、能量和信息网络的改变为通 络药物干预阻断心血管事件链提供实验支持。 2.4 通络药物的药效物质、作用机制及临床研究 选择通络代表性药物通心络、参松养心及芪苈强心胶囊，通过复方中药的化 学物质组系统分离， 结合多 维多息指纹图谱等组效化学分析方法，围绕临床疗效 特点建立多指标活性筛选方法，初步 阐明其不同类别物 质基础和作用机制。采用 随机双盲、对照、多中心研究方法，开展参松养心胶囊治 疗室性早搏伴心功能不 全、芪苈强 心胶囊治疗慢性心力衰竭的 临床循证评价。 二、预期目标 1.总体目标 围绕营卫“ 由络以通、交会生化”异常引起渗灌气血、濡养代谢、津血互换障 碍与“孙络-微血管” 多维时 空动态演变的物质-能量 -信息网络紊乱的相关性，阐 明 AMI 无再流、脑梗死、DN 的共性病理机制，揭示易损斑块、AMI、心律失常、 心力衰竭心血管事件链的内在机制，寻找有效干预策略，明确通络方药异病同治 不同微血管病变性重大疾病、有效阻断心血管事件链的物质基础及作用机制，创 新发展脉络学说的营卫“ 由 络以通、交会生化 ”理论，提高上述重大疾病临床防治 水平。 2.五年预期目标 2.1 阐明营卫“ 由络以通、交会生化”异常导致渗灌气血、濡养代谢、津血互换障碍 与“孙络-微血管” 物质- 能量-信息网络紊乱的相关性。探讨宏观证候类型的 “孙络 微血管”微 观病理改变，借助理化实验手段， 阐明孙络滋生、疏失、瘀阻、绌急 病理改变的微观特征。 2.2 揭示“孙络 -微血管” 病 变损伤心脑肾导致 AMI 无再流、急性脑梗死、DN 异病 同治的共性病理机制：建立“心肌灌注单元” 新概念，明确“微血管 EC 损伤”在 AMI 再灌注后心肌无再流和再灌注损伤产生中的核心作用并揭示通络干预作用 机制；以脑微血管结构与功能研究为核心，在整体动物与离体细胞实验，阐明急 性脑梗死微血管结构功能及血脑屏障损伤的动态病理演变规律，围绕神经血管 单元探讨通络干预脑梗死的微血管作用机制，发展脑微血管 EC 介导的脑神经保 护技术平台；阐明糖尿病微血管损伤所致肾小球系膜基质增生、足细胞损伤及肾 间质纤维化的发病机制及通络药物干预作用。 2.3 揭示易损斑块、AMI、心律失常、心力衰竭心血管事件链微血管病变的内在机 制：揭示斑块内新生血管、新生淋巴管及二者协同在斑块易损中的作用，阐明抑 制 VEGF-A 和 VEGF-C 的表达在抑制斑块内微循环 ，稳定斑块中的机制及通络 干预作用，揭示斑块内血管新生与缺血组织微血管减少的内在机制；阐明 AMI 电重构、结构重构、神经重构导致心律失常的发病机制及通络干预作用，探 讨心 衰与心律失常相互影响及通络药物干预作用；阐明心肌微循环障碍、能量代谢与 信息调控异常对心力衰竭发病的影响，明确心肌缺血所致心脏重构对心力衰竭 发生发展的影响机制，探讨通络药物防治心力衰竭的作用。 2.4 初步阐明通心络保护缺血再灌注损伤微血管、参松养心快慢兼治心律失常、 芪苈强心胶囊标本兼治慢性心衰的药效物质基础及作用机制；为参松养心治疗室 性早搏伴心功能不全、芪苈强心治疗慢性心力衰竭提供循证医学证据。 2.5 创新发展脉络学说营卫“由络以通、交会生化 ”理论，培养高层次脉络病变基 础与临床研究队伍，发表论文 120-140 篇，其中 SCI、EI 收录 60 篇左右，申请专 利 5 项左右，主办国际学术会议 3-5 次， 扩大国际学 术影响力，国内学 术会议 5 次，培养博士、硕士研究生 70-80 人。 3.五年预期取得的进展、突破及科学价值 3.1 理论创新创新发展脉络学说的营卫“由络以通、交会生化”理 论 揭示营卫“由络以通、交会生化” 异常引起渗灌气血、濡养代谢、津血互 换 障碍与“孙络-微血管”物质-能量-信息网络紊乱的相关性，阐明以微血管 EC 为核心和启动因素、神经体液 调节与血液细胞共同参与、脏腑组织细胞功能结构 损伤、多 维时空动态演变的 “孙络-微血管”物质-能量-信息紊乱的复杂病理变化， 揭示脉络病变宏观临床证候类型的“孙络微血管”病变微观病理改变，阐明 孙络绌急、瘀阻、滋生、疏失的微观病理特征，创新发展脉络学说的营卫“由络 以通、交会生化”理论。 3.2 治疗创新开辟微血管病变性重大疾病的异病同治及阻断心血 管事件链的通络治疗新途径 通过研究营卫“ 由络以通、交会生化”异常与“孙络- 微血管” 物质-能量- 信息网 络紊乱对心、脑、肾重要脏器的影响，揭示 AMI 无复流、急性脑梗死、DN 的共性 病理机制，阐明易损斑块、AMI、心律失常、心力衰竭心血管事件链的内在机制， 继承创新中医通络干预及治疗方药的特色优势，开辟微血管病变性重大疾病的 异病同治及阻断级联反应病理进程的通络治疗新途径。 3.3 模式创新创建“源于经典、基于临床、创新理论、研发新药、 提高疗效”的中医药发展新模式 本项目将基础实验研究、临床循证评价、 药效物质与作用机制研究有机结合， 创 新发展脉络学说营卫“ 由络 以通、交会生化 ”理论，阐明通络方药的物质基础与作 用机制，采取国际公认又体现中医特色的随机双盲、多中心循证研究，客 观评价 通络方药的临床疗效，为提高心脑血管病、 DN、心律失常、心力衰竭等重大疾病 的临床防治水平提供理论指导和有效药物，为探索现代高科技条件下的中医药 创新发展模式提供有益借鉴。 三、研究方案 （一）总体研究思路、技术路线及可行性分析 1.项目假说 营卫“由络以通、交会生化”异常引起渗灌气血、濡养代谢、津血互换障碍与 多维时空动态演变的“孙络-微血管” 物质能量信息紊乱密切相关，是心 脑血 管病及 DN 发展加重的共性病理机制，也是心血管事件链的内在机制，通络干预 可对微血管病变性重大疾病进行异病同治，也可有效阻断心血管事件 链。 2.总体研究思路 以“源于经典、基于临床、 创新理论、研发新药、提高疗效” 为指导思想，在既 往系统构建脉络学说，系统 研究脉络病变发病规律、临床证候类型及辨证治疗， 从营卫交感与血管内皮-中膜-外膜相互影响阐明血管病变病理演变及防治规律 基础上， 进一步围绕营卫“由络以通、交会生化” 异常所致渗灌气血、濡养代谢、津 血互换障碍与多维时空动态演变的“孙络-微血管” 物 质-能量-信息网络紊乱相关 性，结合微血管病变影响心、脑、肾主要脏器而导致的重大疾病，吸取现代微循 环研究可视化动态成像、彩色微球、核素扫描、声学造影等先进技术手段，阐明 以微血管 EC 为核心和启动因素、神 经体液调节与血液 细胞参与的、脏腑组织细 胞功能结构损伤的、多维时 空动态演变的“孙络-微血管 ”物质交换、能量代谢及信 息调控网络紊乱的复杂病理变化规律。探讨脉络病变宏观临床证候类型的“ 孙络 微血管”病 变微观病理改 变，揭示孙络绌急、瘀阻、滋生、疏失的微观病理特征， 揭示 AMI 无再流、急性脑 梗死、 DN 异病同治的共性机制，阐明易损斑块、AMI、 心律失常、心力衰竭心血管事件链的内在机制。 寻求异病同治微血管病变性重大 疾病及阻断心血管事件链的通络干预策略和药物，探讨通络方药的物质基础与 作用机制，创新发展脉络学 说的营卫“由络以通、交会生化”理论，提高微血管病 变性重大疾病的临床防治水平。 3.项目研究的技术路线 心 积心 力 衰 竭心 悸心 律 失 常揭 示 营 卫 “由 络 以 通 、 交 会 生 化 ”异 常“孙 络 微 血 管 ”物 质 能 量 信 息 网 络 紊 乱 相 关 性急 性 脑 梗 急 性 心 梗 无 再 流 糖 尿 病 肾 病心 血 管 事 件 链 内 在 机 制开 展 通 络 药 物 药 效 物 质 、 作 用 机 制 与 临 床 评 价 研 究创 新 发 展 脉 络 学 说 的 营 卫 由 络 以 通 、 交 会 生 化 理 论 项 目 总 体 学 术 思 想“营 在 脉 中 ， 卫 在 脉 外 ”营 卫 不 通 ， 血 凝 不 流 伤 寒 论 内 经 “损 其 心 者 ， 调 其 营 卫 金 匮 要 略 难 经 血 脉 相 传 ， 壅 塞 不 通 ”脉 络 学 说 营 卫 理 论 为 指 导 心 脑 肾 异 病 同 治 共 性 机 制 3.1 基础实验研究 3.1.1 营卫“由络以通、交会生化”异常与微血管病变相关性及微观病 理特征研究 采用可视化动态成像、彩色微球、转录因子芯片、基因启动子芯片等先进技 术手段， 阐明以微血管 EC 介导的、神 经体液调节与血液细胞参与的、脏腑组织 细胞功能结构损伤的、多维时 空动态演变的“孙络- 微血管” 物质交换、能量代谢及 信息调控网络紊乱的复杂病理演变规律。采用兔心导管介入冠状动脉封堵、麦角 新碱冠脉注射、月桂酸钠注射建立孙络滋生和孙络疏失、孙络绌急、 孙络瘀阻模 型。应用活体微循环、定量放射自显影、血管内超声显像系统、冠脉造影技术等 观察微血管形态、通透性及血流变化， 电镜观察微血管 EC 超微结构，采用生化、 Western blot、免疫组化检测与 EC 通透性、紧密连接、凋亡相关因子及血管活性 物质水平和表达，探讨脉络 病变宏观临床证候类型的 “孙络微血管”病变孙络 绌急、瘀阻、滋生、疏失的微观病理特征。 3.1.2 微血管病变损伤心脑肾重要脏器导致 AMI 无再流、急性脑梗 死、DN 异病同治的共性病理机制研究 采用高血脂和糖尿病引起 EC 损伤基础上建立猪 AMI 再灌注损伤模型，采 用心脏导管、心脏超声、彩色微球、病理、分子生物学方法研究 AMI 无再流与再 灌注损伤的微血管 EC、心肌灌注 单元保护的分子机制及信号 调节机制。 采用激光多普勒、激光散斑血流视频监测进行定点脑血流、区域内脑血流检 测，采用免疫组化观察脑微血管结构、功能特征性改变；对脑微血管 EC、神经元 及胶质细胞对脑微血管调节作用的研究，观察脑微血管 EC 与神经元及胶质细胞 相互关系；应用核磁、PET-CT 等影像技术， 观察脑 梗死患者梗死灶和缺血半影区 的神经- 血管形 态、生化与功能变化特征。 从整体、器官、细胞、分子水平采用可 视化连续性微循 环观察系统、Western- blot、RT-PCR、血清 药理学、共聚焦激光扫描电镜等技术，研究 DN 微血管血流 动力学异常和 EC 功能障碍、 肾小球细胞外基质增生、 肾小球足细胞损伤、肾小 管上皮细胞转分化发病机制。 阐明通络药物对微血管病变性重大疾病异病同治 的作用机制。 3.1.3 易损斑块、AMI、心律失常、心力衰竭心血管事件链微血管病 变的内在机制研究 通过高脂喂养的 apoE-/-小鼠 AS 模型，观察新生血管、淋巴管与斑块易损性 的关系；以 VEGF 靶点体内转染病毒载体介导的 VEGF-RNAi 或/ 和 VEGF-C- RNAi，观察斑块内微循环 、病变进程及斑块易损性的变化；体外培养血管 EC 和 淋巴管 EC，给予 VEGF 或/和 VEGF-C 过表达、VEGF-RNAi 或/和 VEGF-C- RNAi，观察通络干预对血管 EC 和淋巴管 EC 功能及其下游信号通路分子的表 达。应用高脂喂养的 apoE-/-小鼠制备动脉粥样硬化易损斑块和心肌梗死并存的 复合动物模型，观察新生血管和淋巴管与斑块易损性以及斑块内孙络滋生与缺 血心肌孙络疏失的内在机制，在同一生物体内同步观察通络药物对缺血心肌和 易损斑块内微血管不同变化的双向调控的分子机制。 建立 AMI 兔模型，采用高频超声诊断仪、 导管、超声造影检测血流动力学、 心功能及心肌灌注情况；采用免疫组化、PCR、Western-blot 等方法观察 AMI 对 微血管功能、心肌细胞电传导 、神 经重构、心肌重构的影响及通心 络、参松养心 胶囊的治疗作用。选取 RGS5 基因敲除小鼠和心脏 特异性 RGS5 转基因小鼠建 立 AMI 模型，应用电生理、膜片钳技术、激光扫描共聚焦显微镜等观察通心络、 参松养心胶囊对 RGS5 转 基因及基因敲除小鼠心肌梗死模型心电生理的影响。 离体培养乳鼠微血管 EC 和冠状动脉结扎小鼠模型自构建慢性心力衰竭模 型，采用形态学、电生理、激光多普勒、超声等技术，观察机械负荷、神经体液因 子对 EC 结构功能的影响，不同病理 阶段微血管分布数量、EC 和心肌结构功能 变化及心肌代谢的影响。阐 明通络药物阻断心血管事件链的内在机制。 3.2 临床循证评价 采取国际公认又能体现中医特色的循证医学临床研究方法，药物设盲、数据 管理和统计分析由第三方统计单位具体实施，开展参松养心胶囊治疗室性早搏 伴心功能不全、芪苈强心胶囊治疗慢性心衰临床评价，为临床提供疗效确切的治 疗药物。 3.3 通络药物药效物质基础及作用机制研究 针对通络代表性药物通心络、参松养心、芪苈强心胶囊，植物药采用系统分 离、光谱 、色 谱 技术， 动物药采用仿生酶解、膜分离、葡聚糖凝胶筛分技术进行分 离确定多活性组分，围绕临床疗效特点通过离体、在体模型进行药效筛选，初步 阐明其不同类别 物质基础和作用 机制 4.取得重大突 破的可行性分 析 4.1 具有取得 重大突破的络 病理论、临床、 药物及广泛的学术基础 项目主持人 30 余年始终致力于络病理论及其临床应用研究，首次系统构建 “络病证治”和“ 脉络学说”理论体系，为络病学学科建立奠定了理论基础，以络病 理论为指导开辟心脑血管病、心律失常、慢性心力衰竭治疗新途径，研制的治 疗 心脑血管病的通心络胶囊、治 疗心律失常的参松养心胶囊、治疗慢性心力衰竭的 芪苈强心胶囊等国家专利新药均在基础与临床循证医学研究中取得良好疗效。 中医络病学学科正式建立并成为国家中医药管理局重点与优势学科，络病学 教材在全国 40 余家及国外新加坡高等医学院校开课，建立了中华中医药学会络 病分会和十多省络病专委会，形成了上千人的络病研究专家队伍，具备本项目取 得创新性突破的理论、临床、药物及广泛的学术基础 。 4.2 本项目与原 973 项目具有延续性和创新性 在既往 973 项目研究中首次提出中医经脉理论包括经络和脉络，系统构建 了对心脑血管等重大疾病具有指导价值的脉络学说，提出了脉络学说的核心理 论营卫承制调平，揭示了 营气与血管内皮、 卫气与血管外膜及 NEI 网络相关 性，从营卫 交感异常与“内皮-中膜-外膜”相互影响全面深刻的揭示了血管病变由 外到内（Outside-in）与由内到外（Inside-out ）的发病机制，通心络稳定易损斑块研 究发表在Am J Physiol Heart Circ Physiol杂志，被 评价为“传统中医药对现代医 学的挑战”，“ 本研究为未来可能发展成冠心病事件的高危患者点燃了希望之灯”； 提出“微血管病 变” 为 AMI 无再流、急性脑梗死、糖尿病微血管并发症的共性核 心机制，开展的基础与临床研究证实了脉络学说的营卫理论重要的临床指导价 值。基于 3469 例血管病变患者临床调查制定“脉络 血管系统病”辨证诊断标准， 提出八类临床证候类型和辨证治疗，为本项目围绕假说深入开展研究奠定了良 好的工作基础。 本项目以脉络学说的营卫理论为指导，界定营卫交会与交感概念的不同，围 绕营卫“由络 以通、交会生化”异常导致的渗灌气血、濡养代谢、津血互换障碍与 “孙络微血管 ”物质能量信息网 络紊乱的相关性，揭示 AMI 无再流、急性 脑梗死、 DN 等微血管病变 性重大疾病异病同治的共性机制，阐明易损斑块、 AMI、心律失常、心力衰竭心血管事件链的内在机制，寻找有效干预策略和治疗 药物，创 新发展营卫“由络以通、交会生化” 理论，不仅体现了原 973 项目研究的 延续性，使中医经典的营卫 理论及通络药物在微血管病变性重大疾病治疗中发 挥指导作用，更增加了脉络 学说营卫理论的原创优势。 4.3 拥有以中医为主体多学科交叉研究队伍和丰富的管理经验 在原承担的 973 项目中，坚持以中医为主体多学科融合的研究方式，形成了 包括山东大学齐鲁医院张运院士、北京阜外心血管医院杨跃进教授、复旦大学中 山医院葛均波教授、北京中医药大学李澎涛教授等高层次西医专家在内的多学 科交叉的研究团队，本项目又增加了中华医学会心电生理和起搏分会候任主任 委员武汉大学副校长黄从新教授、河北医科大学党委书记温进坤教授、人民解放 军总医院杨明会教授等，体 现了以中医为主体多学科交叉的专家组成特色，项目 主体研究人员中涵盖了中医、西医、中西医结合、生物化学、分子生物学、微循环 研究领域专家，为项目顺利开展提供了专家团队支持。 前期项目制定了项目内部管理办法，设立有项目办公室，配备专职人员负责 项目内部管理与外部协调，建立了项目网络平台共享研究数据，实行课题研究月 报、季报 与年报制度，建立项目内部学术交流会议制度，在人才培养、基地建设、 文章发表、 组织管理、数据共享、国 际学术交流、 经费使用等方面积累了丰富的 经验，为 本项目的顺利开展奠定了良好基础。 4.4 具备高水平实验研究平台，掌握项目研究领域的关键技术和方法 课题承担单位拥有教育部神经与血管生物学重点实验室、卫生部心血管重 构与功能研究重点实验室、教育部心血管基因和分子遗传重点实验室、卫生部心 血管再生医学重点实验室、 卫生部心血管药理学重点实验室、省部共建国家重点 实验室培育基地、国家中医 药管理局络病重点研究室（心脑血管）、河北省络病重 点实验室（GLP 认证）、国家中医药管理局三级实验室、北京市重点实验室等，拥 有生化、电生理、分子生物学、蛋白 质组学、 细胞学、现代药学、生物医学信息处 理等多个技术服务平台，具 备多种高性能实验设备与仪器，为项目的开展提供有 力的实验技术支持。 申报单位不仅掌握激光多普勒脑血流监测、激光散斑血流视频监测系统，可 动态观察微血管血流与形态结构，同时还掌握核素扫描、声学造影、彩色微球 、 PET、PET-CT 等技术，可观察心脑组织中微循环血流灌注情况，从而更系统的研 究微血管自身病变及其对心脑重要脏器的影响。同时掌握基因沉默、基因敲除、 蛋白质芯片、转录因子芯片等 细胞与分子生物学关键技术，可深入研究微血管功 能及相关信号转导通路变化。掌握大孔树酯、膜分离等系统分离方法、葡聚糖凝 胶筛分、仿生酶解、组合光谱技术等，可开展通路药 物药效物质基础与作用机制 研究。上述技术平台及研究技 术为顺利开展基于微血管病变的重大疾病研究及 通络药物药效物质与作用机制提供了有力保障。 （二）与国内外同类研究相比的创新点与特色 1.首次阐明营卫“由络以通、交会生化”异常与“孙络-微血管”物质- 能 量-信息网络紊乱相关性 在前 973 项目系统构建脉络学说基础上，创新发展脉络学说营卫理论，对 “营卫交感”与“ 营卫交会生化”概念进行诠释和界定，首次提出营卫“由络以通、交 会生化”异常与 “孙络-微血管 ”物质-能量-信息网络紊乱相关性，阐明以微血管 EC 为核心和启动因素、神经体液 调节与血液细胞共同参与、脏腑组织细胞功能结构 损伤、多 维时空动态演变的 “孙络-微血管”物质-能量-信息紊乱的复杂病理变化， 突出显示了脉络学说营卫理论在微血管病变性重大疾病防治中的重要指导价值， 并为揭示其病理演变规律提供实验数据支持。 2.开辟微血管病变性重大疾病异病同治及阻断病程的通络治疗新途 径 围绕营卫“由 络以通、交会生化”异常引起渗灌气血、营养代谢、津血互换障 碍与“孙络-微血管” 物质- 能量-信息网络紊乱相关性，揭示 AMI 无再流、急性脑 梗死、DN 异病同治的共性机制，阐明易损斑块、AMI 、心律失常、心力衰竭心血 管事件链的内在机制，为通 络干预的异病同治及阻断心血管事件链的病理进程 提供理论支持，发挥脉络学 说的营卫“由络以通、交会生化”理论的原创优势，开 辟通络治疗微血管病变性重大疾病的治疗新途径。 3. 采用循证方法开展通络药物临床评价研究，阐明通络药物物质基 础和作用机制 以通络复方通心络胶囊、参松养心胶囊及芪苈强心胶囊为代表方药，通过复 方中药的化学物质组系统分离，结合多维多息指纹图谱等组效化学分析方法，围 绕临床疗效特点建立多指标活性筛选方法，初步阐明其不同类别物质基础和作 用机制。采用随机双盲、对照、多中心研究方法，开展参松养心治疗室性早搏伴 心功能不全、芪苈强心治疗 慢性心衰的循证医学研究，客观评价通络药物的临床 疗效。 4.创建“源于经典、基于临床、创新理论、研发新药、提高疗效”的 中医药发展新模式 既往“络病证 治” 与“脉络学说”理论体系建设是在传 承前人理论与通络药物 经验基础上的原始理论创新， “理论原创临床实践 创新药物”三位一体运行机 制是络病理论创新的成功模式，也体现了“源于经典、基于临床、创新理论、研发 新药、提高 疗效” 的中医药发展新模式，对中医基础理论原创研究的促进作用。在 既往脉络学说的营卫理论基础上，开展营卫“由络以通、交会生化”异常与“孙络 微血管”物 质能量信息网 络紊乱相关性研究，综合基础实验、临床评价与 药效物质研究，通过数据分析系统整合，揭示微血管病变性重大疾病异病同治的 共性机制与心血管事件链的内在机制，寻找有效干预策略和治疗药物，体现了与 原 973 项目的延续性和创新性，通过创新发展脉络学说的营卫“ 由络以通、交会 生化”理论，增强脉络学说营卫理论的原创优势和特色，通过经典营卫理论的创 新发展，提高微血管病变性重大疾病的防治水平，促进通络创新药物的研发， 为 现代高科技条件下中医药基础理论发展模式提供有益借鉴。 （三）课题设置 课题 1 课题名称：营卫“由络以通、交会生化”异常与微血管病变相关 性及微观病理特征研究 研究目标：探讨营卫“ 由络 以通、交会生化 ”异常引起的渗灌气血、濡养代谢、 津血互换障碍与“ 孙络-微血管 ”物质-能量-信息网络 紊乱相关性，阐明以微血管 EC 为核心和启动因素、神 经体液调节与血液细胞共同参与、脏腑组织细胞功能 结构损伤、多维时空动态演 变的“孙络-微血管”物质-能量-信息紊乱的复杂病理变 化。探讨 脉络病变宏观临床 证候类型的“孙络微血管 ”微观病理改变，借助微血 管动态可视技术和相关理化检查手段，揭示“孙络微血管 ”病变孙络绌急、瘀阻、 滋生、疏失的微观病理特征。 主要研究内容： （1）研究生理和微血管病变条件下，血小板、单核/巨噬细胞与 EC 相互作用 的异同，探讨微血管病理改 变对血小板募集、 单核/巨噬细胞黏附、内皮重建和血 管新生的影响，揭示不同条件下血管 EC 与血液细 胞相互作用所激活的胞内信号 途径。 （2）应用二维凝胶电泳、PF-2D 目标蛋白快速分离、质谱技术、代谢组学研究 技术, 确定 EC、平滑肌和心肌细胞在生理和病理环境中所释放的活性物质，明确 其所激活的信号网络以及受其调控的转录因子和基因，研究基因表达产物对内 皮细胞的影响和机制以及对微血管结构与功能的调节。 （3）采用高糖和缺氧条件 培养 EC、平滑肌和心肌细 胞， 观察其 ONOO-与 ANP 交互作用对物质和能量代 谢的影响及机制。 （4）利用基因表达谱分析和蛋白质组学技术，筛选低氧诱导 EC、 平滑肌细胞和心肌细胞差异表达的与能量代谢和物质转运相关的关键基因，探 讨低氧对心肌细胞 VEGF、NO、组织因子和 ROS 等化学信号分子生成、物质和 能量代谢的影响，利用其条件培养基，观察对血管祖细胞归巢、增殖和分化能力 的影响及对 EC 移行和血管新生的影响。研究低氧 诱导对血管祖细胞-EC、骨髓 干细胞-心肌细胞相互作用的影响和偶联机制,同时在整体水平进行验证。 采用马来酸麦角新碱冠脉注射制备兔孙络绌急模型，心导管介入冠状动脉 封堵建立兔孙络滋生和孙络疏失模型，兔主动脉月桂酸钠注射制备建立孙络瘀 阻模型。应用活体微循环、免疫组化、光镜观察微血管形 态学变化，应用定量放 射自显影观察冠脉微血管通透性，血管内超声显像、冠脉造影观察冠脉形态及血 流动力学变化，同时记录心 电图动态变化。 应用电镜观 察微血管 EC 超微结构， 生化、原位杂交、Western blot、免疫 组化检测微血管 EC 紧密连接相关蛋白 claudin-5、occludin、纤维粘 连蛋白及体现 EC 通透性的 MMP 表达，检测与血管 新生相关的 VEGF、PDGF、Ang、 TGF- 表达以及凋亡相关因子和血管活性物 质 iN0S、eN0S、ET-1、ICAM-1、Ang等水平和表达，阐明“ 孙络微血管”病变 微观病理特征。 承担单位：河北医科大学、中国人民解放军总医院 课题负责人：温进坤 主要学术骨干：杨明会、韩梅、李 绍旦、齐锦生、李玉珍 经费比例：22% 课题 2 课题名称：心脑肾重大疾病异病同治的微血管共性病理机制研 究 研究目标：在高血脂和糖尿病损伤 EC 的基础上，围绕 “心肌灌注单元”明确 “微血管 EC 损伤 ”在 AMI 再灌注后心肌无再流和再灌注损伤的核心作用，揭示 通络干预通过微血管有效保护心肌灌注单位，减少心肌无再流和再灌注损伤的 作用机制。以脑微血管结构功能及其与脑组织细胞相互作用关系为核心，观察脑 梗死时微血管结构功能变化特征，揭示脑微血管 EC 与神经元及胶质细胞相互影 响的特征改变，临床研究观察脑梗死不同阶段的脑影像学变化，揭示通络干预脑 梗死的微血管机制。围绕 DN 微血管血流动力学异常和 EC 功能障碍、肾小球细 胞外基质增生、肾小球足细胞损伤、 肾间质纤维化，阐明肾之脉络营卫交会生化 异常与“孙络 微血管” 物 质-能量-信息网络紊乱的相关性及通 络干预作用机制。 主要研究内容： 急性心梗无再流的微血管发病机制及通络干预研究：采用高脂、高糖饮食建 立猪高血脂和糖尿病 AMI 再灌注模型， 导管法测定左室收缩压和左室舒张末压、 左心室内压最大收缩和舒张变化速率、心排量、心率，超声法 测定心脏结构与功 能改变。 观察毛细血管渗透性、心肌和左室含水量，彩色微球测定心肌血流量。 采用硫磺素、Evans blue 染色观察心肌无再流范围，四氮唑红染色观察梗死心肌 面积，光 镜观察心肌灶性出血率、粒细胞浸润、微血管 EC 和心肌细胞损伤程度， 电镜观察其超微结构及自噬体形成情况。 采用免疫荧光 检测示踪细胞自噬， CD31 和 CD34 标记血管内皮观察血管新生，TUNEL 法和 DNA 电泳检测细胞凋 亡。测定循 环 EC 计数、心肌 NO 水平和 NOS 活性， ELISA 法测定组织 ATP、 ROS、MDA 含量、髓 过氧化物酶活性。 利用免疫组 化、免疫荧光和 Western blot 法检测再流区和无再流区心肌组织中反应 mTOR 通路活性 （mTOR、p- mTOR、eIF4E、STAT-1, 3 和 5）、微血管 EC 的结 构和功能完整性、EC 分泌的保 护因子、白 细胞与 EC、血小板与 EC、淋巴细胞与 EC 相互作用 、氧化应激和炎症 反应、细 胞凋亡、细胞自噬和血管新生等蛋白的表达改变。 急性脑梗死的微血管发病机制及通络干预研究：（1）采用大鼠大脑中动脉栓 塞建立脑梗死模型，应用激光多普勒监测定点脑血流，激光散斑血流视频监测区 域内脑血流灌注，应用在体微循环观察仪对正常及急性脑梗死动物大脑皮层表 面的细小血管进行观察。采用光、电镜观察脑微血管 结构，免疫 组化、ELISA 法 检测微血管密度、微血管成分及生成相关因子表达和水平，实时动态检测 pO2/CO2评估脑微血管物质交换功能。光、电镜观察脑神经元结构，高效液相色 谱法检测脑组织能量负荷，同 时观察神经元结构与功能。 （2）提取脑微血管 EC 条 件培养液，生物芯片检测与血管舒缩功能、凝血与抗凝、介 导血细胞与血管内皮 粘附、介导血管内皮炎症损伤及神经细胞损伤、保 护或修复相关的活性因子并进 行在体定位及定量分析;提取神经元、胶质细胞条件培养液，分别作用于脑微血 管 EC，观察其活性变化，在上述研究中应用通络干预观察其作用机制。 （3）以脑梗 死急性期、恢复早期和恢复期临床患者为研究对象，应用核磁、 PET-CT 等影像 分析技术，观察通络干预前后，梗死灶和缺血半影区的神经-血管形态、生化与功 能变化特征。 糖尿病肾病的微血管发病机制及通络干预研究：（1）整体动物采用高脂饮食+ 链脲佐菌素注射建立糖尿病大鼠模型，观察大鼠肾功能和尿白蛋白含量，测定神 经体液因子和血管活性物质的水平和 mRNA 表达，同 时观察内皮细胞结构与功 能、血小板功能、凝血抗凝功能、血流变相关指标的变化。离体细胞采用高糖刺 激人脐静脉内皮细胞株（ECV-304）观察 EC 形态、通透性、 细胞凋亡、增殖、周期 变化、血管活性物质、氧化 应激及相关信号通路表达。 （2）在上述大鼠模型中采用 电镜观察 DN 大鼠肾脏病理， 肾功能改变，采用 酶联 免疫、 Western Blot、RT-PCR 方法，观 察 DN 大鼠肾组织 中 ECM 成分、生长因子、 ECM 降解酶系，信号转导 通路 p38MAPK、NF-B，糖基化 终产物 AGEs 和受体 RAGE 的的表达。离体实验 采用高糖刺激的 ECV-304 和肾小球系膜细胞共培养及单独培养， 观察通络方药 对三种模型中内皮细胞(ET-l) 表达及细胞上清液基质成分合成的影响，对相关细 胞因子蛋白和基因水平及 p38MAPK 的影响。 （3）采用自发性 2 型糖尿病 KK-Ay 小鼠模型及 TGF-1 刺激的体外肾小管 上皮细胞转分化模型，观察通 络方药对 2 型糖尿病 KK-Ay 小鼠肾间质纤维化病 理改变的影响，检测介导 EMT 的关键信号通路 TGF-smad2/3、标记蛋白 E- cadherin、-SMA、促进/抑制纤维化因子、降解 酶系等指 标蛋白和基因水平的表 达。 （4）采用 STZ 诱导建立糖尿病 肾病模型，观察大鼠足细胞数目、足突、尿白蛋 白、肾功能变化和检测裂孔隔膜蛋白、胞骨架蛋白 的蛋白和基因水平的表达。 用 永生化足细胞系构建体外细胞模型，检测裂孔隔膜蛋白、胞骨架蛋白、 型胶原 -5 链的表达，上清液中 MMP-2、MMP-9 的活性，足细胞黏附率变化。 承担单位：中国医学科学院阜外心血管病医院、北京中医药大学、首都医科 大学 课题负责人：杨跃进 主要学术骨干：李澎涛、高彦彬、赵京林、潘彦舒、耿建国、李向东、李卫红、 张红 经费比例：32% 课题 3 课题名称：易损斑块微血管滋生及通络干预机制研究 研究目标：揭示斑块内新生血管、新生淋巴管、二者协同在 AS 发展、斑块易 损中的作用，阐明抑制 VEGF-A 和 VEGF-C 的表达在减少斑 块内微血管新生，抑 制稳定斑块及通络干预的作用机制。探讨同一生物体易损斑块孙络滋生与缺血 心肌孙络疏失的内在机制及通络干预双向调节的分子机制。 主要研究内容： （1）构建VEGF-A和VEGF-C的过表达载体和抑制性 载体。（2）培养人主动脉 EC和淋巴管内皮细胞，应 用ELISA法检测VEGF-A和VEGF-C表达，检测细胞增 殖、迁移、血管形成能力、细胞衰老和凋亡、ICAM-1，VCAM-1 等炎症因子水平， 免疫组化、 Real time RT-PCR 和Western blot检测 P38、JNK和ERK信号通路关键 分子表达。（3）通过高脂喂养和颈总动脉外周套管建立apoE-/-小鼠颈动脉斑块模 型，给予通心络和辛伐他汀干 预。 动态观察新生血管及新生淋巴管生长情况及斑 块稳定性，同时进行体内VEGF 基因转染， 检测血脂、炎性因子、纤维蛋白原水平、 循环EC及循环淋巴内皮细胞数量，采用微型 CT显示局部新生血管三维图像、彩 色微粒法测定微循环局部血流量、免疫组化分析斑块内新生血管和新生淋巴管 相关指标水平，同时观察微血管EC通透性、斑块内细胞凋亡率、MMP-2、MMP-9 活性，并进行颈总动脉斑块稳定性和血栓形成的评价。（4）建立apoE-/- 小鼠颈动 脉斑块合并AMI模型，采用辛伐他汀、通心络进行干 预。超声 观察心功能，检测血 脂、炎性因子、纤维蛋白原、 RASS、Ach、N、NE、5-HT、DA水平,同时观察循环 EC数量、微血管EC通透性、颈动脉斑块微血管密度、斑块内细胞凋亡率。采用微 型CT显示梗死心肌内微血管三维图像，彩色微粒法测定心肌微循环局部血流量； 免疫组化、实时定量RT-PCR及Western blot法检测心肌内微循环密度、分布和巨 噬细胞的含量，检测心肌内血管新生和淋巴管新生、微血管EC 活性因子和炎性指 标表达。 承担单位：山东大学 课题负责人：赵玉霞 主要学术骨干：刘运芳、倪梅 经费比例：10% 课题 4 课题名称：急性心梗致心律失常发病机制及通络干预研究 研究目标：阐明急性心梗对电重构、结构重构、神 经重构影响导致心律失常 的发病机制，探讨通心络和参松养心胶囊对上游调控靶点 RGS5 影响及阻断心 血管事件链（急性心梗-心律失常-心力衰竭）的作用机制。 主要研究内容： 采用兔 AMI 模型，应用通心络、参松养心胶囊干 预 ，以免疫 组化、放免法、 RT-PCR、Western blot 法等检测血液及心肌中 EC 相关活性因子 VEGF、ET、PGI2、NO、Ang、 CNP 的含量及表达。高频超声诊断仪检测心功能， 导管检测血流动力学，超声造影检查观察心肌灌注情况，通过在体电生理研究观 察心电生理变化特性。观察心肌细胞电传导（Cx43 在细胞、蛋白、基因水平的分 布与表达）、心室肌细胞钙调 控（L 型钙电流特性，钙通道基因和蛋白表达，心肌 细胞钙瞬变、钙转运蛋白）、心室肌结构重构（心肌纤维 化、胶原 纤维分布、胶原 纤维容积分数、TGF- 、CTGF、MMP-2、 MMP-9、MAPK 信号通路）、神经重构 （NGF、神经营养因子 TrkA、p75NTR、炎症介质、 GAP43 和 TH 的分布）的表达 及活性。选取 RGS5 基因敲除小鼠和心脏特异性 RGS5 转基因小鼠建立 AMI 模 型，观察存活率及心功能，在体/离体电生理观察心律失常自发、心室激动传导、 心律失常诱发、心脏回复特性情况，激光扫描共聚焦显微镜检测细胞钙瞬变。 承担单位：武汉大学人民医院 课题负责人：黄从新 主要学术骨干：黄鹤、王晞、唐艳红 经费比例：10% 课题 5 课题名称：急性心梗致心力衰竭发病机制及通络干预研究 研究目标：在细胞、整体水平从心肌微循环、微血管新生异常和能量代谢障 碍切入，明确急性心梗与心脏重构和心力衰竭发生发展的机理，并探讨通络干预 作用机制。 主要研究内容： （1）培养乳鼠微血管 EC，观察缺氧损伤对 EC 形态、舒缩功能、血管新生、粘 附功能、细胞凋亡及炎症反 应等指标的影响及通络干预作用，通过基因芯片和蛋 白组学寻找并筛选通络干预的关键靶点，采用 siRNA 干扰和基因转染方法进行 验证。 （2）采用 C57B/L6 小鼠，建立心肌梗死致心衰模型与心衰+运动平板模型， 应用芪苈强心胶囊进行干预， 动态观察不同部位心肌微血管数量和形态，FITC 标记血浆白蛋白细静脉外漏出，ELISA 法检测血中 eNOS、NO、ET-1、HIF- 1、VEGF、ICAM-1、VCAM-1、TNF-、IL-2、IL-6、IL-10、MMP 和 TIMP 水平，采 用病理、光镜、TUNEL 的方法 观察不同时期心肌组织变化，超声检测心脏功能， 探讨血管新生在心力衰竭中的作用。同时检测血脂、血糖、不同部位心肌 细胞和 线粒体形态数目、Na +-K+-ATPase 活性、胞浆 ATPase 活性和肌酸含量。采用 RT- PCR 和 Western Blot 方法检测不同部位 PPAR 和 PCG-1 表达与 GLUT- 1、GLUT-4 含量并观察 PPAR 和 PCG-1 表达与心 脏功能改变的关系，采用蛋白 质组学观察能量代谢相关酶类的变化，检测心肌细胞线粒体功能，超声检测心脏 功能，对 于不同干预组小鼠采用基因芯片、蛋白芯片筛选芪苈强心胶囊作用靶点， 采用 siRNA 干扰/ 基因转染的方法 结合 Realtime-PCR、Western Blot 方法验证明 确关键的分子机制及调控原理，探讨能量代谢在心力衰竭中的作用。 承担单位：复旦大学附属中山医院 课题负责人：周京敏 主要学术骨干：邹云增、姜红 经费比例：10% 课题 6 课题名称：通络药物物质基础、作用机制及临床评价研究 研究目标：初步阐明通络代表性药物通心络、参松养心、芪苈强心胶囊的药 物物质基础及作用机制；通过临床循证医学研究，客观评价参松养心治疗室性早 搏伴心功能不全、芪苈强心治 疗慢性心衰的临床疗效，为临床提供疗效确切的治 疗药物。 主要研究内容： 选择通络代表性药物通心络、参松养心及芪苈强心胶囊，植物药采用系统分 离、光谱 、色 谱 等技术， 动物药采用仿生酶解、膜分离、葡聚糖凝胶筛分等技术对 复方中药的化学物质组进行系统分离，结合多维多息指纹图谱等组效化学分析 方法，围绕 通心络干预心脑组织缺血再灌注微血管损伤、参松养心快慢兼治心律 失常、芪苈强心强心、利尿、扩血管、抑制心室重构等临床疗效特点建立在体、离 体多指标活性筛选方法，初步 阐明其不同类别物质基础和作用机制。采用国际公 认随机双盲、对照、多中心又体现中医特色的循证医学 临床研究方法， 药物设盲、 数据管理和统计分析由第三方统计单位具体实施，开展参松养心胶囊治疗室性 早搏伴心功能不全、芪苈强 心胶囊治疗慢性心衰的临床循证评价。 承担单位：河北以岭医药研究院有限公司 课题负责人：吴以岭 主要学术骨干：王宏涛、贾振华、高学 东、贾继明 经费比例：16% （四）各课题间的相互关系以及与项目总体目标和五年目标的关系 围绕项目假说，开展营卫“由络以通、交会生化” 异常引起的渗灌气血、濡养 代谢、津血互换障碍与“孙络-微血管”物质-能量- 信息网络紊乱相关性及微观病理 特征研究，阐明以微血管 EC 为核心和启动因素、神经体液调节与血液细胞共同 参与、脏 腑组织细胞功能结 构损伤、多 维时空动态演 变的“ 孙络-微血管”物质-能 量-信息紊乱的复杂病理变化及微观病理特征（课题 1），围绕“孙络-微血管” 病变 影响心、脑、 肾 三大重要脏器而导致的 AMI、急性脑 梗死、DN，阐明其异病同治 的微血管损伤共性机制（课题 2），以及易损斑块（课题 3）、心律失常（课题 4）、心 力衰竭（课题 5）心血管事件链的内在机制，寻找有效干预策略及有效方药，阐明 其物质基础与作用机制，开展通络方药的临床评价研究（课题 6）。 项目体现“二横四 纵” 的课题设 置思路，课题 2 是研究“孙络-微血管” 损伤心、 脑、肾重要 脏器所致临床重大疾病，探讨其共性机制将 为通络干预的异病同治提 供实验数据支持；课题 3、4、5 均为“孙络- 微血管”引起心血管事件链的重大疾病， 探讨其级联反应的内在机制，将为治中寓防、防治 结 合、阻断 级联反应的病理进 程开辟新的有效治疗途径；课题 1、6 围绕“孙络-微血管 ”病变共性规律及通络药 物的物质基础作用机制及临床评价研究，为其余课题组提供支持，同时开展数据 分析、系统整合，创新发展脉络学说的营卫“由络以通、交会生化”理论，增 强脉络 学说营卫理论的原创优势，为提高上述重大疾病的临床防治水平提供理论指导， 课题设置强调了各子课题对项目理论原始创新的贡献。 四、年度计划 研究内容 预期目标 第 一 年 1、研究微血管病变对血小板募集、 单核/巨噬细胞黏附、内皮重建和 血管新生的影响，检测 EC 与血液 细胞相互作用所激活的胞内信号 途径及其对细胞增殖、迁移、凋亡 的影响；开展孙络绌急的中医微 观病理特征研究。 2、在心脑肾异病同治研究中，采 用高糖饮食建立猪糖尿病 AMI 再 灌注模型，开展血流动力学、病理 学及生化分子生物学等样本检测。 开展急性脑梗死脑微血管结构、 功能变化及通络干预机制研究及 脑组织细胞结构、功能变化及通 络干预机制研究。开展糖尿病肾 病（DN）肾间质纤维化机制及通络 方药的作用靶点研究。 3、在心血管事件链研究中，围绕 易损斑块构建 VEGF-A 和 VEGF- C 的过 表达载体和干扰性载体；围 1、揭示孙络- 微血管病变中 EC 与 血液细胞相互作用的变化规律和 特征，明确其影响细胞生物学行为、 血管新生及微血管结构与功能的 细胞与分子机制；完成孙络绌急的 微观病理特征研究。 2、在心脑肾异病同治研究中，揭 示糖尿病损伤 EC 前提下 AMI 再 灌注