兔巴氏杆菌-波氏杆菌二联蜂胶疫苗的研制及安全、效力试验.docx

兔巴氏杆菌-波氏杆菌二联蜂胶疫苗的研制 及安全、效力试验 兔巴氏杆菌-波氏杆菌二联蜂胶疫苗的 研制及安全、效力试验 兔多杀性巴氏杆菌病(Pm)和兔支气管败血波氏杆菌病 (Bb)是家兔的两种主要细菌性传染病,它们传播迅速,一旦 在兔场暴发流行,很难根除,经济损失惨重。进行疫苗接种 是预防这两种疾病的最有效的措施。免疫原性好的菌(毒) 种和良好的免疫佐剂是保证疫苗免疫效力的必要条件。因 此,在 Pm和 Bb基础菌种研究的基础上,对蜂胶的提取工艺 进行了研究,选取了蜂胶乙醇提取液的水溶物作为佐剂,研 制疫苗,并进行了疫苗的安全及效力试验。现将该研究结果 报告如下。 1 材料与方法 1.1 仪器及材料 1.1.1 菌种 兔多杀性巴氏杆菌 Pm90株(对家兔的致死 剂量为 8-10个活菌,对小鼠的致死剂量为 100个活菌);兔 支气管败血波氏杆菌 Bb82株(对小鼠的致死剂量为 1107 个活菌,对家兔的致病剂量为 1108个活菌)。 1.1.2 试验动物 不同日龄的健康大耳白兔 1.1.3 培养基 含 3%小牛血清的马丁琼脂平板(SMS)、 马丁肉汤(MB)、硫乙醇酸盐培养基(T.G)、酪胨琼脂(G.A)、 葡萄糖蛋白胨汤(G.P)等。 1.1.4 细胞瓶 1.1.5 蜂胶 1.1.6 仪器 GQ(F)75管式分离机、索氏回流装置、 温控式旋转蒸发器 1.2 试验方法 1.2.1 Pm90 菌液的制备及检验 1.2.1.1 一级种子的繁殖与鉴定 用灭菌生理盐水适当 稀释 Pm90株第 9代冻干菌种,接种于 0.1%绵羊血红素的马 丁琼脂平板(BMS)上,37培养 18h,然后选取 5-10个典型菌 落,分别接种于 10%绵羊鲜血琼脂斜面若干,同上培养后,作 为一级种子。在 4保存,可使用 7日。继代次数不超过 3 代。 1.2.1.2 二级种子的繁殖及鉴定 将 Pm90株一级种子接 种于适量马丁肉汤中,置 37振荡培养 18h,取样用 SMS培 养基作纯粹检验;置 4保存,可使用 3日。 1.2.1.3 制苗用菌液的培养 将 Pm90株二级种子接种于 SMS培养基,37培养 18h,无菌水洗下菌苔,取样做纯粹检 验,同时用平板菌落计数法计算菌液浓度,将菌液浓度调整 为 200108个/ml。 1.2.1.4 菌液的灭活 加入 0.4%的甲醛溶液于菌液中, 容器密封后,37灭活 48h,其间振摇 6-8次,然后进行灭活 检验。本研究灭活检验及无菌检验用的培养基为: SMS、T.G、G.A 和 G.P。置 37条件下培养 48h,无细菌生 长说明已完全灭活。 1.2.1.5 菌液的离心、冻融 灭活检验合格的菌液用管 式分离机离心除去甲醛,无菌刮下菌苔,用等量的灭菌生理 盐水配成原浓度的菌液。小量分装后反复冻融 3次,再次进 行无菌检验。 1.2.2 Bb82菌液的制备与检验 将 Bb82株第 7代冻干 菌种接种于 BMS培养基上,37条件下培养 24h,然后选 5- 10个典型菌落,分别接种于 10%绵羊鲜血琼脂斜面若干,同 上培养后,作为一级种子。置 4保存,可使用 7日。继代不 超过 3代。二级种子的繁殖以及制苗用菌液的培养、灭活、 离心及冻融参照 1.2.1 1.2.3 蜂胶佐剂的制备 经过工艺优化选择,我们采用 了醇提水溶法来制备蜂胶佐剂。蜂胶原胶在-20冰柜中冷 冻过夜使变脆,取出后研磨粉碎,放入深色瓶中,按 1：4 的 比例加入 80%的乙醇,充分搅拌,置 70索氏回流 2h,然后于 旋转蒸发器中 50浓缩成浸膏状。通过试验,选择合适的助 溶剂,将蜂胶浸膏溶于 pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS),然后配 制成 40mg/ml的溶液 4避光保存备用。 1.2.4 配苗 将上述 Pm90菌液与 Bb82菌液等量混匀后 作为水相,蜂胶乙醇提取液作为佐剂相,水相与佐剂相等量 混匀后加入终浓度为 0.01%的硫柳汞,置胶体磨中以 8000r/min搅拌 5min,然后 1XXr/min搅拌 5min。无菌检验 合格的,即可分装至疫苗瓶中,加塞、封蜡置 4保存备用。 实验室共生产兔巴氏杆菌-波氏杆菌二联蜂胶疫苗 6批,批 号分别为:010510、010521、010615、010628、010709 和 010720。 1.2.5 成品检验 6个批次的兔巴氏杆菌-波氏杆菌二联 蜂胶灭活疫苗均进行了物理性状、无菌检验以及安全检验。 其中安全检验分 3组进行,每组均使用了不同日龄 (30、90、180 天)的健康大耳白兔各 20只。接种后观察 3 周,记录家兔的临床反应、体温以及是否有组织病变。3 个 组的试验设计如下:一次单剂量接种组的疫苗接种量为 2ml/ 只;单剂量重复接种组为 2次接种,中间间隔 1周,剂量为 2ml/只;一次大剂量接种组的疫苗免疫量为 6ml/只,采用皮 下多点注射的方式进行。 1.2.6 兔巴氏杆菌波氏杆菌二联灭活苗的效力试验 兔巴氏杆菌部分取 4批二联苗(批号: 010521、010615、010709、010720),分为 3个免疫剂量: 1、2、3ml,分别注射 1月龄左右的健康家兔各 20只,5 只作 正常对照。3 周后每只接种 Pm90株致死量,观察 14天,记录 每组的死亡数。 兔波氏杆菌部分取 4批二联苗(批号: 010615、010628、010709、010720),分为 3个免疫剂量: 1、2、3ml,分别注射 1月龄左右的健康家兔各 20只,5 只作 正常对照。3 周后每只接种 Bb82株致病量,以家兔咳嗽、鼻 腔排出水样或脓样的鼻液,取鼻腔拭子能分离到 Bb82株作 为发病标准。观察 14天,记录每组的发病数。 2 结果 2.1 疫苗的物理性状检验 本品为棕黄色均匀混悬液,长期静置后底部有少许沉淀,可 混匀。 2.2 疫苗的无菌检验 待检菌液在 SMS、T.G、G.A、G.P 培养基上进行无菌检 验,均无细菌生长。 2.3 疫苗的安全性检验 各批次的疫苗接种家兔后,家兔的体温、食欲无明显变 化,注射部位也无红肿及硬结。 2.4 疫苗的效力试验 2.4.1 家兔对巴氏杆菌的免疫保护试验结果 对照组的 家兔在 3天内全部死亡,从兔体的心、肝、脾、肾中都分离 到了巴氏杆菌。2ml 以上试验组的死亡保护率均在 90%以上 (见表 1)。 表 1 家兔对巴氏杆菌的免疫效力试验 批次 攻毒保护率 1ml 组 2ml 组 3ml 组 对照组 010521 60 95 95 0 010615 60 90 100 0 010709 55 100 100 0 010720 65 95 90 0 2.4.2 家兔对波氏杆菌的免疫保护试验结果 对照组的 家兔在 3天内全部发病并自鼻腔拭子中分离到了兔支气管 败血波氏杆菌,2ml 以上试验组的发病保护率均在 90%以上 (表 2)。 表 2 家兔对波氏杆菌的免疫效力试验 批次 攻毒保护率 1ml 组 2ml 组 3ml 组 对照组 010615 70 100 90 0 010628 60 95 100 0 010709 75 100 95 0 010720 65 95 90 0 3 结论与讨论 3.1 关于菌液的生产工艺 制苗用兔巴氏杆菌及波氏杆菌菌液的培养采用了(血清)马 丁琼脂平板培养的方法,不仅容易得到高浓度的纯菌液,也 避免了液体培养时菌液中非抗原物质对动物机体的影响;菌 液灭活后经管式分离机离心去甲醛,从而避免了疫苗中的非 抗原性化学物质对动物造成不必要的刺激;离心后的菌液经 反复冻融,可使细菌的细胞壁破裂或通透性增加,细菌细胞 内的多种抗原成分被释放出来,这样配苗时各抗原组分与蜂 胶佐剂的相互作用更加充分,从而可增强疫苗的免疫效果。 3.2 关于蜂胶佐剂的提取工艺 蜂胶疫苗自问世以来,已在多种畜禽传染病的预防中得 到应用。遗憾的是,用于疫苗佐剂的蜂胶,大多是蜂胶的乙 醇粗提液。本研究中,我们采用了 80%的乙醇来提取蜂胶,既 能提取到蜂胶中的黄酮类等醇溶成分,又能保留一部分水溶 性的活性物质。所得的蜂胶醇提液用温控式旋转蒸发器蒸 发掉乙醇,然后通过大量试验,选择了适当的助溶剂,使蜂胶 浸膏可以以任意比例与水互溶,这样就避免了乙醇对动物体 强烈的刺激作用,增强了疫苗的安全性。疫苗的效力试验表 明,我们选择的这种助