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从法医相关性昆虫体内提取人类 DNA 的研 究进展 【摘要】本文从嗜血性昆虫、嗜尸性昆虫、嗜骨性昆虫及 实验技术等多角度阐述了从法医相关性昆虫嗉囔中提取人 类 DNA 的可 行性及国际研究和应用进展。 【关键词】法医昆虫学；嗉囔；个体识别；DNA 【中图分类号】D9191 【文献标识码】B 【文章编号】10079297(XX)04030804 随着分子生物学技术的发展，DNA 在刑事案件及 民事案件中发挥了巨大的作用。对于死亡重罪中的个 体识别及将罪犯与现场的关联方面DNA 技术屡建奇 功。而在亲子鉴定，打击拐卖人口方面，DNA 技术也展 现了其非凡的魅力。目前较常见有从现场血痕、毛发、 牙齿、香烟过滤嘴及搔抓当事人时指甲缝中的残留物 中提取扩增 DNA。同时，作为新兴学科，法医昆虫学在 人类 DNA 的提取扩增中逐渐得以应用。 法医昆虫学是介于法医学和昆虫学的交叉学科， 主要用于刑事案件中被害人死亡时间的推断(PMI)。 【作者简介】万香波(1980- )J，河南 XX 人，中山大 学基础医学院法医病理研究生。Tel：+8620- 33080271，E-mail：Wan1712eyoucom 通信作者】王江峰，法医病理博士后，副教授；研究 方向：法医昆虫学。 基金项目】国家自然科学基金项目“基于嘈尸性昆虫 的死亡时间推断”(基金编号：30100216)；广东省自然科 学基金项目(基金编号：001386) 法律与医学杂志 XX 年第 12 卷(第 4 期) 目前法医昆虫学方法已被认为是腐败尸体死亡时间 推断最有效的方法。除此之外，法医昆虫学亦可用于 死亡地点、死者中毒情况甚至死者身份的判别。日常 临案工作常见的为嗜尸性、嗜血性昆虫。由于其在现 场取食尸体组织，叮吸当事人的血液，因而扩增其胃 肠道(即嗉囔)中未消化的人的 DNA、线粒体 DNA，则 可望成为谋杀、强奸等案件以及用于死亡时间推断的 昆虫是否与被害人尸体相关中个体识别的直接证据。 嗉囔作为昆虫的食物储存器官而非消化器官。故而没 有蛋白水解酶的分泌。虽然昆虫在吞噬食物时其唾液 中有少量蛋白酶，但这种预消化对宿主 DNA 的降解 很少。故而对嗉囔内容物中的宿主 DNA 进行提取、扩 增则成为个人识别的理想底物。 一 、法医相关性昆虫 (一)嗜血性昆虫 临案工作中常见的嗜血性昆虫为虱和蚊。由于其 常常从一宿主转移至另一宿主，因而使之成为强奸、 谋杀等案件中当事人曾在案发现场的有力证据。 法医临案中常见的蚊为按蚊(Diptera：Culicidae)， 最 初常用免疫学方法通过对血型的检验进行个体识别 的粗筛以及确定被蚊吸食的脊椎动物的种系。1,21 随 后 的研究发现，用 PCR 方法从按蚊(Diptera：Culicidae)的 嗉囔(blood mea1)中扩增宿主 DNA，其吸食血液后的 消化时间在 0，8，16，24，32h 时与宿主 DNA 的成功 扩 增率在逻辑回归曲线上呈明显的负相关，且宿主 DNA 扩增的成功率在吸食后 1224 h 时下降得最快(P= 0001)。但通过对扩增的 TC 一 11、VWA 两段短串联 重 复序列(STR)的观察发现，在上述任一时点嗉囔内血 量的多少对两位点的成功扩增影响不大，且在同一时 点，两位点扩增的成功率几乎相等(P=085)。此外， 周 围环境对蚊的消化速率影响较大，32cc 时的消化速率 为 22cI=时的两倍。通过在实验室温度为 27、吸食 血 液后最长 32 h 时仍可扩增出宿主 DNA 的事实，可知 在温度升高或降低时其成功扩增的极限时间亦随之 缩短或延长。31 由此可见，由于分子生物学中 PCR 技 术的成熟，使微量 DNA 的成功扩增成为可能。因而从 蚊的嗉囔中提取扩增宿主 DNA 时，影响扩增成功与否 的主要因素是吸食后的消化时间而非嗉囔内血量的 多少。 寄生于人身上的虱分为体虱与头虱。Replogle 等网 最早于 1994 年从 17 只阴虱的排泄物中通过 AMP FLP 技术获得了人类特异性基因座 D1S180 及 HUMTHO1，其与阴虱所寄生的宿主相一致，但是 Re plogle 并未扩增出完整的 DNA。Lord 等51 在 1999 年 成功地从阴虱 Pthirus Pubis(L)中分离、扩增出宿主 的 线粒体 DNA(mtDNA)。人类线粒体 DNA(mtDNA)位于 核染色体外，具有组织特异性，为共价闭合的环状双 链 DNA 分子。没有重组、倒置、易位等突变现象，具有较 高的保守性，组成也相当稳定，严格遵守母系遗传。 人 类线粒体 DNA 大小为 165Kb，包括 2s rRNA、22s tRNA 及 13 个编码特定功能多肽的基因。6,71 每一个 体 细胞内核 DNA 仅有两个拷贝，而线粒体 DNA 却有上 千个拷贝。因而在细胞的量较少或是检材高度降解， 难 以对核 DNA 成功扩增时，对线粒体 DNA 进行扩增，结 果则较为理想。目前此技术已广泛地应用于人的毛 发、骨、牙齿等的检验。【蝴由于体虱常从一宿主转 移至 另一宿主，Mumcuoglu 等【 从 2 只体虱中成功扩增出 与其所寄生宿主相符的混合 DNA，体虱在吸食血液后 的 20h 内，用于个体识别的基因座 D16S539、D7S820、 D13S317 均可同时扩增。值得注意的是，欲从虱消化道 中提取宿主 DNA 至少需要 2 只体虱或是 6 只头虱。 这是因为头虱体型较小，每次吸食的血量亦较少，但 是 其消化速率却较体虱要快。另外欲成功提取宿主 DNA，须用消毒棉签将虱捣碎，否则无法进行 PCR 扩 增。且因提取物较少，故为保证成功扩增，至少需要 35 个循环。显而易见，虱由于其活动范围局限，仅在密 切 接触时才从一宿主转至另一宿主，因而在诸如强奸等 案件中，若能从中提取并用 PCR 扩增出当事人双方的 DNA 或线粒体 DNA，则可为庭审提供最有力的证据。 但其最大的局限性在于其时效性若吸食的血液 已被完全消化，则无法进行 PCR 扩增，此时可尝试用 AMP-FLP 技术对虱排泄物进行分析，以寻找相关的基 因信息。 (二)嗜尸性昆虫 在法医检案中常常遇到这样的情形：现场除蝇蛆 外无其他阳性发现，而蝇蛆是该处曾发生动物体腐烂 的直接证据。若能从蝇蛆嗉囔中提取出宿主 DNA，则 可有力地证明现场移尸的推断。同理，通过尸体上滋 生 的嗜尸性昆虫可对高度腐败的尸体进行死亡时间推 断(PMI)。11 141 若可从其嗉囔中获得宿主 DNA，即 可证 明其与尸体的依存关系，而非暂时寄生或路过。此时 即 可通过嗜尸性昆虫的发展演替规律进行准确的死亡 时间推断。 Richard Zehner 等151 通过对 10 具尸体上的丽蝇 (Diptera，ealliphoridae)、2 具尸体上的麻蝇 (Diptera， Sareophagidae)、1 具尸体上的家蝇 (Diptera，Muscidae) 310 的研究发现。除未能从其中 4 具尸体上附着的蝇蛆嗉 囔中获得 STR 外。其余 9 具尸体上附着的蝇蛆嗉囔中 均获得与寄生宿主一致的 STR(其中 7 具尸体上蝇蛆 嗉囔中的 STR 较完整，其余 2 具的不完整。其中一具 已死亡 4 个月由于所处其温度较低使得 DNA 的降 解速率减慢。故而亦成功地扩增出完整的宿主 DNA)。 考虑到现场尸体在滋生寄生昆虫时均已有不同程度 的腐败。DNA 的降解亦随之发生。鉴于核 DNA 与线粒 体 DNA 在体细胞内拷贝数的巨大差异。当无法提取 扩增出核 DNA 时。运用 PCR 技术扩增线粒体 DNA。 其结果相对较为理想。上述 4 例未成功扩增出核 DNA 的，随后在对线粒体 DNA 的高变区(HV I，HV)进 行扩增时均获成功。大量研究证明：蝇蛆的种类对 STR 分型的结果无影响。某些类似 Sarcophagidae 的麻 蝇在其幼虫发育的最后阶段会噬食其他蝇蛆的幼虫。 此时未被后者消化的宿主 DNA 则随之进入前者的嗉 囔内。此时仍可从前者的嗉囔中成功获得后者所寄生 宿主的 STR。在某些特殊情况下需确定嗜尸性昆虫所 寄生的宿主的种系(如猪、牛、人等)时，可分析确定 其 Cytochrome b 的基因序列而后对比基因库中何种与 此序列相符，即可确定。 (三)嗜骨性昆虫 在尸体腐败的后期，软组织因腐败而逐渐软化、 液化直至完全溶解消失，最后仅剩下骨骼(即白骨 化)。在白骨化时先前寄生于尸体上的蝇蛆大部分已 迁徙他处，现场仅留下少数的嗜骨性甲虫。法医检案 中常见的是露尾甲幼虫 Omosita spp(Coleoptera：Ni tidulidae)。由于白骨化时骨中的核 DNA 大部已降解 完毕，因而线粒体 DNA 则成为宿主识别的重要标 志。Dizinno 等 D6从在野外已暴露数月的人肋骨上获 得露尾甲幼虫 Omosita spp(Coleoptera：Nitidulidae)。 而后成功地运用 PCR 技术获得了与死者母亲相符 的线粒体 DNA，从而确认了死者的身份。由此可见 在尸体达到白骨化时，在无其他方法证明尸体身份 时，通过嗜骨性甲虫嗉囔内容物则可进行死者个体 识别。 二、实验技术对结果的影响 从现场采集的昆虫标本。为防止其嗉囔中 DNA 成分的进一步降解，需立即处理。传统的保存方法是 采用福尔马林、酒精等保存液。Linville 等【2】观 察了 70酒精、95酒精、Kahle 氏液、福尔马林、一 70cI=、 4cI=、24cI=等 7 种保存方法对线粒体 DNA 及 STR 分型 的影响。结果显示：福尔马林保存 DNA 的效果最差 法律与医学杂志 XX 年第 12 卷(第 4 期) 70酒精、95酒精的效果较好。即使经过 6 个月。 提 取 DNA 进行线粒体 DNA 及 STR 分析的成功率仍较 高。且温度对其影响不大，4cI=与 24cI=时，在 70 酒精 中保存的效果相当。在 Kahle 氏液中存放两周的标本 只能进行线粒体 DNA 的序列分析而无法进行核 DNA 的 STR 分析，8 周时则二者均不可。4cI=及 24cI= 且无保存液时。二者效果与酒精相当。一 70cI=时即使 经 过 6 个月线粒体 DNA 及核 DNA 的 sTR 分析的成 功率与现场采集的新鲜标本相同(因为低温降低了消 化酶的活性，使降解停止，且低温使细菌无法存活)。 值得注意的是，一系列的实验表明，欲成功地进行 PCR 扩增。从嗉囔中提取的 DNA 的极限浓度为 006 ngtxl。 在从嗉囔中提取宿主 DNA 时，应将嗜尸性昆虫及 蚊的嗉囔从其体内取出，而后将之捣碎，但捣碎之前 最 好先将之置于一 70cI=环境中。一方面，使之取出后易 于 捣碎：另一方面，使之被捣碎时对 DNA 双链连续性的 破坏较小。从而易于进行 PCR 扩增。 三、结束语 由于分子生物学技术的发展，使得微量分析成为 可能。从案发现场常见的昆虫之嗉囔中提取扩增宿主 核 DNA、线粒体 DNA，依据 STR 分型、限制性片段长 度分析进行个体识别具有良好的应用前景此方面有 待于进一步的深入研究。 参考文献 【l】 Weitz BIdentification of blood meal of blood-sucking arthropods 叨 Bull World health Org，1956，15：473-490 2】 Boreham PFL。Some application of blood meal identification in relation to the eoidemiology of vector-borne tropical disease J】J Tmp Med Hygiene，1975，78：83-91 3】Mukabana WR，Takken Seda et a1Extent of digestion afects the success 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HU、318 HU 和 387 HU。其中3 只动物的 CT 图像肉眼可以分辨出 梗死灶。考虑可能由于本实验所选择测定 CT 值的范 围较大，所选范围内可能既包含梗死区域也包含非梗 死区域，从而导致了两侧大脑半球所测范围 CT 值的 差值偏小。 梗死灶的大小、部位、缺血程度决定着梗死灶在 CT 上的表现时间。肖恩华等同报告，250 例脑梗死患 者 中有 8l 例在 6 h 内 CT 出现阳性表现， 占 324 。 Kueinski 等11】研究发现有 84的患者于起病后 2h 行 CT 平扫可出现脑实质密度降低。这些结果间的差异， 主要与作者选择病例的标准不同有关。本实验是利用 线栓阻断大脑中动脉主干血流完全阻断，不会发生 梗死局部漏血或血管再通现象；梗死范围较大同一 时间缺血范围基本一致：梗死过程迅速，于线栓插入 后立即发生。因此，本实验中大鼠脑梗死后 CT 征象出 现相对较早，易于观察。结果表明，缺血后 3 h，5 只 动 物中有 3 只出现肉眼可分辨的梗死灶，占 60。其他 脑梗死模型的实验结果可能会存在一定程度的差异。 本实验结果说明在血管栓塞性脑梗死中梗死后 3 h 进行 CT 平扫，60的动物出现肉眼可见的低密度 灶，可以为此类脑梗死的早期诊断提供实验依据和临 法律与医学杂志 XX 年第 l2 卷(第 4 期) 床参考。但由于外伤性脑梗死有多种致伤因素不同 机理所引起的脑梗死出现 CT 征象的时间不尽相同 要依据 CT 征象准确的判断梗死时间尚需进行大量 的实验研究和进一步探讨。但本实验通过测定梗死 健、患侧 CT 值的差值并结合临床表现可以作为推断 脑梗死发生时间的一种参考方法。 参考文献 1】刘运生，欧阳姗神经系统疾病诊断治疗学 M】XX：人民军医出版 社，XX，382 2】 肖芝豹，郭小蓝，赖文雄，等大脑中动脉供血 区早期脑梗塞 CT 诊断 JJ中国现代医学杂志，XX，13(14)：9596 3】 陈彦芳，吴恩惠，刘国栋，等实验性急性脑梗 塞早期 CT 表现与病理 基础研究J】中华放射学杂志，1994，28(12)： 843845 4】徐茂竹CT 扫描在大面积脑梗死中的应用JJ临 床荟萃，XX，16(17)： 803803 5】 Zea Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et a1Reversible midd