第七章外源基因的表达

第七章 外源基因的表达第一节 外源基因在原核细胞中的表达1.原核生物基因表达的特点 与真核细胞相比，原核细胞的基因表达有以下特点：（ 1）原核生物只有一种 RNA聚合酶（真核细胞有三种）识别 原核细胞的启动子，催化所有 RNA的合成。（ 2）原核生物的基因表达是以操纵子为单位的。（ 3）由于原核生物无核膜，所以转录与翻译是偶联的，也是连续进行的。（ 4）原核基因一般不含有内含子，在原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统。（ 5）原核生物基因的控制主要在转录水平，这种控制要比对基因产物的直接控制要慢。（ 6）在大肠杆菌 mRNA的核糖体结合位点上，含有一个转译起始密码子及 16S核糖体 RNA 3 末端碱基互补的序列，即 S-D序列，而真核基因则缺乏此序列。2.原核表达系统的注意事项 从上述特点可以看出，欲将外源基因在原核细胞中表达，必须考虑表达载体、外源基因的性质、原核细胞的启动子和 S-D序列、阅读框架及宿主菌调控系统等基本条件，也就是说必须满足以下条件：（ 1）通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的酶系统合成外源蛋白。（ 2）外源基因不能带有内含子，因而必须用 cDNA或化学合成的基因，而不能用基因组 DNA。（ 3）必须利用原核细胞的强启动子和 S-D序列等调控元件控制外源基的表达。（ 4）外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读框架。（ 5）利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，防止外源基因的表达产物对宿主菌的伤害。3.原核生物基因表达的调控序列 只有在了解了原核生物基因表达调控序列的基础上， 才能够构建高效的表达载体，使外源目的基因在原核细胞中得到高效率、高水平地表达。对于原核细胞来讲，基因表达的调控序列主要涉及启动子、 S-D序列、终止子、增强子、衰减子等序列。（ 1）启动子启动子 (promoter)是 DNA链上一段能与 RNA聚合酶结合并能起始 mRNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。没有启动子，基因就不能转录。原核生物的启动子是由两段彼此分开且高度保守的核苷酸序列组成。 -35区（ TTGACA） ：位于转录起始位点上游的 -35bp附近，是RNA聚合酶初始识别和结合位点。 -10区（ Pribnow框， TATAAT） ： RNA聚合酶结合于此处导致DNA双链形成单链。原核表达系统中通常使用的可调控的强启动子有 lac（乳糖启动子）、 trp（色氨酸启动子）、 PL及 PR（ 噬菌体左向和右向启动子）、 tac（乳糖和色氨酸的杂合启动子）等。（ 2）终止子在一个基因或一个操纵子的 3 端往往有一个特定的核苷酸序列，它有终止转录的功能，这一段 DNA序列称为终止子（terminator)。终止子在结构上有一些共同的特点，即有一段富含 A/T的区域和一段富含 G/C的区域， G/C区域具有回文对称结构，使转录后的 RNA具有茎环结构。根据转录终止作用类型，终止子可分为两种：依赖于 因子的转录终止子及不依赖于 因子的转录终止子。（ 3） S-D序列S-D序列是位于起始密码子（ AUG）上游 310bp处的由 39bp组成的序列。这段序列正好与 16S rRNA 3 端序列互补，是rRNA的识别和结合位点。S-D序列存在与否及 S-D序列与起始密码子之间的距离，是影响 mRNA翻译成蛋白质的主要因素之一。（ 4）增强子增强子（ enhancer)是能够增强启动子转录活性的 DNA顺式作用序列。4.几种类型的原核表达载体 在原核细胞中表达外源基因时，由于实验设计的不同，总的来说可以产生融合型和非融合型表达蛋白。不与细菌的任何蛋白或多肽融合在一起的表达蛋白称为 非融合蛋白 。 融合蛋白 指蛋白质的 N末端由原核 DNA序列或其它 DNA序列编码， C端由真核DNA的完整序列编码。（ 1）非融合型表达蛋白载体 pKK223-3具有一个强的 tac（ trp-lac）启动子，这个启动子是由 trp启动子的 -35区、 lac UV5启动子的 -10区、操纵基因及 S-D序列组成。紧接着 tac启动子的是一个取自 pUC8的多位点接头，使之很容易把目的基因定位在启动子和 S-D序列之后。在多位点下游的一段 DNA序列中，还包含一个很强的 rrnB核糖体 RNA的转录终止子。载体的其余部分由 pBR322组成。（ 2）分泌型克隆表达载体 pIN III系统这个载体系统是由 pBR322为基础构建的。带有大肠杆菌最强的启动子之一，即 Ipp（脂蛋白基因）启动子。在启动子的下游装有 lac UV5的启动子及其操纵基因，并把 lac阻遏子的基因（ lac I）也克隆到这个质粒上。这样目的基因的表达就成为可调节的了。在转录控制的下游再装上人工合成的高效翻译起始序列（ S-D序列及 ATG）。信号肽序列取自于大肠杆菌中分泌蛋白的基因 ompa（外膜蛋白基因）。在编码序列的下游紧接着一段人工合成的多克隆位点片断，包括三个单一酶切位点， Eco RI、 Hind III、 Bam HI。（ 3）融合蛋白表达载体 pGEX系统载体的组成成分基本上与其它表达载体相似，含有启动子tac及 lac操纵基因、 S-D序列、 lacI阻遏蛋白基因等。这类载体与其它表达载体不同之处在于 S-D序列下游是谷胱甘肽巯基转移酶基因，而克隆的外源基因则与谷胱甘肽巯基转移酶基因相连。当进行基因表达时，表达产物为谷胱甘肽巯基转移酶和目的基因产物的融合蛋白。5.外源基因在大肠杆菌中的表达部位 （ 1）不同表达部位克隆在大肠杆菌中的外源基因，它们的编码产物蛋白质，有的是在细胞质中表达，有的是在细胞周质中表达，还有的则是以分泌到细胞外的方式表达。 细胞质中表达大肠杆菌细胞质中表达的外源蛋白，大多是以包含体的形式存在的。包含体是存在于细胞质中的一种由不溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构。 周质中表达周质是指在大肠杆菌一类格兰氏阴性细菌中，位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。周质中表达的蛋白需要在信号肽的引导下才能穿越内膜，进入细胞周质。 细胞外表达表达的外源蛋白分泌到胞外培养基中，同样需要信号肽序列的引导。（ 2）不同部位表达外源蛋白的优缺点表达部位 优 点 缺点细 胞 质1、形成包涵体（ a）蛋白 质 易于以高 纯 度和高 浓 度的方式分离（ b）蛋白 质 受保 护 而免受胞内 酶 的降解作用（ c）蛋白 质 没有活性，因此不会使寄主 细 胞受 伤害2、蛋白 质产 量高3、表达的 质 粒 载 体构建比 较简单1、形成包涵体（ a）蛋白 质 折叠了，再折叠的蛋白 质 可能无法恢复其生物学活性（ b）蛋白 质 的 终产 量偏低（ c）蛋白 质 生 产 成本比 较 昂 贵2、 还 原的 环 境不利于二硫 键 的形成3、由于 N-末端存在甲硫氨酸，使蛋白 质 的真 实 性受到影响4、蛋白 质 会被降解5、蛋白 质 种 类 多，因此 纯 化比 较 复 杂周 质1、由于周 质 中蛋白种 类 比 较 少，因此目 标 蛋白 质的 纯 化就比 较简单2、蛋白 质 降解的程度不甚 严 重3、促 进 了二硫 键 的形成及蛋白 质 的折叠作用4、蛋白 质 的 N-末端 结 构真 实1、信号 肽 并非 总 是有助于蛋白 质 的 转 运2、有可能形成包涵体胞外1、蛋白 质 的降解作用程度最低2、由于分泌到胞外的蛋白 质 种 类 少，因此目 标 蛋白 质 容易 纯 化3、增 进 了蛋白 质 的折叠作用4、蛋白 质 的 N-末端 结 构真 实1、在大 肠 杆菌中表达的外源真核蛋白 质 ，通常是不会分泌到胞外培养基中去的2、由于分泌在胞外培养基中的蛋白 质 相当稀 释 ，因此目 标 蛋白 质 的 纯 化 过 程比 较 复杂表 7.1 不同部位表达外源蛋白的优缺点6.影响外源基因表达效率的因素及提高表达水平常用的方法 （ 1）启动子结构对表达效率的影响原核生物启动子有两种保守序列，即 -35区的 TTGACA序列和 -10区的 TATAAT序列。研究发现，启动子的强度与一致序列的相似程度成正比。进一步的研究表明， -35和 -10区的距离也是一个重要因素。如果间隔为 17个碱基对，启动子表现很强，如果大于 17个碱基对，启动子表现较弱。根据这些原理， Amann等克隆了 tac启动子（ lac-trp），促进了克隆基因的表达。（ 2）转译起始序列对表达效率的影响S-D序列的保守性、 S-D序列后面的 4个碱基成分以及起始密码子 AUG左侧的密码三联体的碱基组成都会影响到外源基因的表达效率。如： UAAGGAGG比 GGAGG高 3 6倍（表达水平 )SD与 AUG间富含 AT有利于翻译AUG左侧的密码三联体为 UAU或 CUU时，转译最为有效；如果是 UUC、 UCA或 AGG时，转译水平将下降 20倍。（ 3）启动子同克隆基因间的距离对表达效率的影响启动子同克隆基因间的距离对表达效率的影响，主要是由于mRNA的 5 末端形成不同的二级结构，从而影响 mRNA的翻译效率。根据上述原理，要提高克隆基因的表达效率，可采用构建克隆库的办法。在库中，将外源基因分别放置在离启动子远近不同的地方。转化后，筛选重组克隆，从中筛选出外源基因表达最强的克隆。（ 4）转录终止区对克隆基因表达效率的影响克隆基因的末端是否存在转录终止区也会影响到克隆基因的表达效率。其原因可能为：若干非必须的转录本的合成，会使细胞消耗巨大的能量用于制造大量非必须的蛋白质。在转录本上有可能出现一些不期望出现的二级结构，从而降低了转译的效率。偶尔会出现启动子阻塞现象。因此，在构建表达载体时，在克隆基因后面安装一个强转录终止子（如 rrnB 终止子）对完全终止转录是必要的，可以阻止通读，增加基因表达。（ 5）质粒的拷贝数及稳定性对表达效率的影响由于细胞中的核糖体数量，与任何一种 mRNA分子数目相比，都是大大超量的，因此，提高克隆基因表达效率的途径之一，是增加相应的 mRNA分子数量。为此，须增加质粒的拷贝数及其稳定性。一般采用松弛型质粒构建外源基因的表达载体，从而达到增加质粒及外源基因拷贝数的目的。质粒载体中含有分配功能区 par，能保证质粒分子在每次细胞周期中都能准确地进行分离，并均等地分配到子代细胞中去，从而达到稳定质粒拷贝数的作用。（ 6） mRNA的稳定性对表达效率的影响原核生物的 mRNA分子的降解速度很快，一般在几秒 几分之间。因此，维持外源基因 mRNA的稳定性可提高其表达效率。一般的作法是给外源基因 mRNA的 5 及 3 端安装 某些结构序列，保护 mRNA不能被降解。如： 3 端茎环结构、转录终止子结构； E.coli ompA转录物的 5 非翻译部分可作为 mRNA的稳定剂。（ 7）遗传密码子的使用对表达效率的影响无论是真核基因还是原核基因，一种特定的氨基酸并不是以等同的频率使用所有的同义密码子，而是使用其中的某一两种。我们将这种遗传密码子使用的非随机性现象，称为密码子使用偏爱性，简称密码子偏爱性。选择和使用大肠杆菌偏爱密码子有利于增加外源基因在大肠杆菌中的翻译效率，从而提高外源基因的表达效率。（ 8）寄主细胞的生理状态对基因表达效率的影响大肠肝菌寄主细胞的生理状态，会或多或少地影响外源基因的表达效率，诸如：培养基营养成分的选择、细胞培养的方式，以及培养的温度和培养基中所溶解的氧的数量等环境参数。不过，有关处于不同生理状态下的大肠杆菌寄主细胞，究竟是怎样影响外源基因的细胞效率的，人们在这方面的知识还是相当贫乏的。图 7.1 原核细胞的启动子序列 图 7.2 原核基因转录的起始 图 7.3 原核基因终止子序列及其结构 图 7.4 非融合型表达蛋白载体 pKK223-3图 7.5 分泌型克隆表达载体 pIN III系统图 7.6 融合蛋白表达载体pGEX系统图 7.7 4个天然启动子和两个人造启动子的 -35区和 -10区的碱基序列图 7.8 三个重组质粒的 cro mRNA二级结构图 7.9 改变 Lac 启动子和克隆基因间距离的一般方法第二节 外源基因在真核细胞中的表达1.酵母表达系统 酵母（ yeast）是一类以芽殖或裂殖进行无性繁殖的单细胞真核生物，是最理想的真核生物基因表达系统。（ 1）酵母表达系统的优点基因表达调控的机制比较清楚，遗传操作相对简便。具有原核生物所不具备的蛋白质翻译后的加工和修饰系统。可将外源基因表达产物分泌到培养基中。对人体和环境安全，不含毒素和特异性病毒。可进行大