第二章基因工程工具酶限制酶

第二章 基因克隆所需的工具酶 一、限制性内切酶 (restriction enzyme)1 限制性核酸内切酶的发现限制性核酸内切酶 ，是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。它们主要是从原核生物中分离纯化出来的。根据 1994年美国出版的 分子生物学百科全书 的统计数字，仅 型核酸内切限制酶一项迄今就已从各种不同的微生物当中，分离出了 2300种以上，可识别 230种不同的 DNA序列。早在本世纪中期，以 Arber等人对入噬菌体在大肠杆菌不同菌株上的平板培养效应的研究为基础，发现了原核生物体内存在着寄生控制的 限制(restriction)和 修饰 (modification)系统。在限制修饰系统中 限制作用 是指一定类型的细菌可以通过限制性酶的作用，破坏入侵的外源 DNA(如噬菌体 DNA等 )，使得外源 DNA对生物细胞的入侵受到限制；而生物细胞 (如宿主 )自身的 DNA分子合成后，通过修饰酶的作用：在碱基中特定的位置上发生了甲基化而得到了修饰，可免遭自身限制性酶的破坏，这就是限制修饰系统中 修饰作用 的含义。2核酸内切限制酶的类型 特性 I型 II型 III型限制和修饰活性单一多功能的酶分开的核酸内切酶和甲基化酶 具有一种共同亚基的双功能的酶核酸内切限制酶的蛋白质结构3种不同的亚基单一的成份 2种不同的亚基 切割位点 在距寄主特异性位点至少 1000bp的地方可能随机地切割位于寄主特异性位点或其附近距寄主特异性位点 3， 端2426bp处甲基化作用的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点识别未甲基化的序列进行核酸内切酶切割 能 能 能序列特异的切割不是 是 是DNA克隆中的用处无用 十分有用 用处不大3核酸内切限制酶的命名法由于发现了大量的限制酶，所以需要有一个统一的命名法。 H O Smith和 DNathans(1973)提议的命名系统，已被广大学者所接受。他们建议的命名原则包括如下几点：（ 1） 用 属名 的头一个字母和 种名 的头两个字母，组成 3个字母的略语表示寄主菌的物种名称。例如，大肠杆菌 (Escherichia coli)用 Eco表示，流感嗜血菌 (Haemophilus influenzae)用 Hin表示。（ 2） 用一个写在右下方的标注字母代表菌株或型 ，例如 Ecok。（ 3） 如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制与修饰体系 ，则以罗马数字表示。因此，流感嗜血菌 Rd菌株的几个限制与修饰体系分别表示为 HindI、 HindII、HindIII等等。（ 4）所有的限制酶，除了总的名称 核酸内切限制酶 R外，还带有系统的名称，例如核酸内切酶 RHindIII。 同样地， 修饰酶则在它的系统名称之前加上甲基化酶 M的名称。相应于核酸内切酶 RHindIII的流感嗜血菌 Rd菌株的修饰酶，命名为甲基化酶 M. HindIII。在实际应用上，这个命名体系已经作了进一步的简化： 由于附有标注字母在印刷上很不方便，所以现在通行的是把全部略语字母写成一行。 在上下文已经交待得十分清楚只涉及限制酶的地方，核酸内切酶的名称 R便被省去。4. 型核酸限制性内切酶的基本特性它具有三个基本特性：a. 在 DNA分子双链的特异性识别序列部位，切割 DNA分子产生链的断裂；b. 2个单链断裂部位在 DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对的；c. 因此，断裂的结果形成的 DNA片段，也往往具有互补的单链延伸末端。a. 识别位点：绝大多数的 II型核酸内切限制酶，都能够识别由 4 8个核苷酸 组成的特定的核苷酸序列。我们称这样的序列为 核酸内切限制酶的识别序列。 切割位点 的一个 共同特点 是，它们 具有双重旋转对称 的结构形式，换言之，这些核苷酸对的顺序是呈 回文结构 ， 例如 ：5-CTGCA G-3, 5-CTGCA G-3,（ a） Pst I切割位点 , 切割后形成 3OH 的单链粘性末端，3-G ACGTC-5， 3-G + ACGTC-5，(b) EcoRI切割位点 ,切割后形成 5-P的单链粘性末端， 5-G AATTC-3 5-G + AATTC-33-CTTAA G-5 3-CTTAA G-5 （ c） EcoRV切割位点 ,切割后形成平末端。 5-GAT ATC-3 5-GAT + ATC-33-CTA TAG-5 3-CTA TAG-5b. 切割类型： 检验了非常大量的实验事例之后发现，由核酸内切限制酶的作用所造成的 DNA分子的 切割类型 ，通常是属于下述两种独特的排列方式之一：（ 1）两条链上的断裂位置是交错地、但又是对称地围绕着一个对称轴排列，这种形式的断裂结果形成具有 粘性末端 的 DNA片段；（ 2）两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心，这样形式的断裂是形成具有 平末端 的DNA片段。c. 产生的末端特征：我们所说的 粘性末端 是指 DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。平末端 的 DNA片段则不易于重新环化。(2) 同裂酶 (isoschizomers)有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶序列，这类酶特称为 同裂酶 (isoschizomers)。同裂酶产生同样的切割，形成同样的末端。例如，限制酶 Hpa 和MspI是一对同裂酶，共同的靶子序列是 CCGG。与同裂酶对应的一类限制性内切酶 ,它们虽然来源不同，识别的靶序列也各不相同 ,但都能产生相同的粘性末端 ,特称为 同尾酶 。常用的 BamH I, Bcl I, Bgl I,Xho I就是一组同尾酶。它们切割 DNA之后都形成由 -GATC- 4个核苷酸组成的粘性末端，很显然，由同尾酶所产生的 DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的，因此在基因克隆实验中很有用处。 (3) 同尾酶 (isocaudamer)由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点，特称之为 “杂种位点”(hybrid site)。 但必须指出，这类杂种位点的结构，一般是不再被原来的任何一种同尾酶所识别的。例如：Sal I（ 5-G TCGAC-3） 和Xho I(5-C TCGAG-3)的消化片段相连，但所形成的重组片段（ 5-GTCGAG-3） 则不能被上述 2种酶的任一种酶识别和切割。但也有例外。5影响核酸内切限制酶活性的因素(1) DNA的纯度核酸内切限制酶消化 DNA底物的反应效率，在很大程度上是取决于所使用的 DNA本身的纯度。污染在 DNA制剂中的某些物质，例如蛋白质、酚、氯仿、酒精、乙二胺四乙酸 (EDTA)、 SDS(十二烷基硫酸钠 )、以及高浓度的盐离子等，都有可能抑制核酸内切限制酶的活性。为了提高核酸内切酶对低纯度 DNA的反应效率，一般采用如下三种方法： 增加核酸内切限制酶的用量 ，平均每微克底物 DNA可高达 10单位甚至更多些。 扩大酶催化反应的体积 ，以使潜在的抑制因素被相应地稀释。 延长酶催化反应的保温时间 。在有些 DNA制剂中，尤其是按微量碱法制备的，会含有少量的 DNase的污染。由于 DNase的活性需要有Mg2+的存在，而在 DNA的贮存缓冲液中含有二价金属离子螯合剂 EDTA， 因此在这种制剂中的 DNA仍然是稳定的。然而在加入了核酸内切限制酶缓冲液之后， DNA则会被 DNase迅速地降解掉。要避免发生这种情况，唯一的办法就是使用高纯度的 DNA。 (2) DNA的甲基化程度核酸内切限制酶是原核生物限制 修饰体系的组成部分，因此识别序列中特定核苷酸的甲基化作用，便会强烈地影响酶的活性。为避免产生这样的问题， 在基因克隆中使用的是失去甲基化酶的大肠杆菌菌株制备质粒 DNA。 (3) 酶切消化反应的温度DNA消化反应的温度，是影响核酸内切限制酶活性的另一个重要因素。不同的核酸内切限制酶，具有不同的最适反应温度，而且彼此之间有相当大的变动范围。大多数核酸内切限制酶的 标准反应温度都是 37 ，但也有许多例外的情况，它们要求 37 以外的其它反应温度。其中有些核酸内切限制酶的最适反应温度低于标准的 37 ，例如 SmaI是 25 、ApaI是 30 ；有些核酸内切限制酶的最适反应温度则高于标准的 37 ，例如 MaeI是 45 、 Bcl I是 50 、 MaelII是55 ；还有些核酸内切限制酶的最适反应温度可高达 60以上，消化反应的温度低于或高于最适温度，都会影响核酸内切限制酶的活性，甚至最终导致完全失活。(4)DNA的分子结构DNA分子的不同构型对核酸内切限制酶的活性也有很大的影响。某些核酸内切限制酶切割超螺旋的质粒 DNA或病毒 DNA所需要的酶量，要比消化线性 DNA的高出许多倍，最高的可达 20倍。此外，还有一些核酸内切限制酶，切割它们自己的处于不同部位的限制位点，其效率亦有明显的差别。据推测，这很可能是由于侧翼序列的核苷酸成份的差造成的。(5) 核酸内切限制酶的缓冲液 核酸内切酶的标准缓冲液的组份包括：氯化镁、氯化纳或氯化钾、 Tris-HCl,-巯基乙醇或二硫苏糖醇 (DTT)以及牛血清白蛋白（ BSA） 等。酶活性的正常发挥，是绝对地需要二价的阳离子，通常是 Mg2+。 对绝大多数限制酶来说，在 pH=7 4的条件下，其功能最佳。 在 “非最适的 ”反应条件下 (包括高浓度的核酸内切限制酶、高浓度的甘油、低离子强度、用Mn2+取代 Mg2+以及高 pH值等等 )，有些核酸内切限制酶识别序列的特异性便会发生 “松动 ”，从其 “正确 ”识别序列以外的其它位点切割 DNA分子。 有些核酸内切限制酶的切割特异性，受所用的缓冲液成份的影响比较明显。例如，最常用的EcoRI限制酶，在正常的情况下，是在 G AATTC识别序列处发生切割作用的，但如果缓冲液中的甘油浓度超过 5 (V V)， 那么其识别序列的特异性就会发生松动，可在 AATT或 PuPuATPyPy序列处发生切割作用。 EcoRI限制酶的这种特殊的识别能力，通常叫做 星号活性 ，以 EcoRI*表示。 6. 限制性内切酶反应的终止消化 DNA样品后，在进一步处理 DNA样品前往往需要钝化内切酶的活性，钝化大多数限制性内切酶的方法是 65 温浴 5分钟。但有些酶，如 BamHI和 Hae 对热稳定，则需加入终止反应液 (如加入 0 5mol L的 EDTA使之在溶液中的终浓度达到 10mmol/L)螯合 Mg2+，以终止反应。此外，还可以用等体积的 酚抽提 酶解产物，提取 DNA。如果用限制性内切酶消化 DNA分子后，为了进行凝胶电泳分析，则可直接加入凝胶电泳加样缓冲液，振荡混合后，直接上样进行凝胶电泳。7. 利用限制酶对 DNA进行消化的具体步骤限制酶消化反应的进行以下是对 0 21 0 ugDNA进行消化的典型反应步骤，如要对更大量的 DNA进行消化，则反应的各个成分须相应放大。1) 将 DNA溶液加入一灭菌的微量离心管中并与适量水混匀，使总体积为 18ul。2) 加入 2ul适当的 10X限制酶消化缓冲液。轻敲管外壁以混匀之。3) 加入 12 单位限制酶，轻