第13章核酸的物化性质

核酸的一般物理性质n DNA为白色纤维状固体， RNA为白色粉末状固体，都微溶于水，其钠盐在水中的溶解度较大。但不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般有机溶剂 。 （用乙醇从溶液中沉淀核酸）n DNA和 RNA在细胞中常以核蛋白形式存在，两种核蛋白在盐溶液中的溶解度不同。DNA核蛋白 RNA核蛋白0.14mol/LNaCl - +1-2mol/LNaCl + - DNA溶液的粘度很大，而 RNA溶液的粘度小得多。核酸发生变性或降解后其粘度降低。 核酸受到强大离心力的作用时，可从溶液中沉降下来，其沉降速度与核酸的大小和密度有关。第 14章 核酸的理化性质一、核酸的水解核酸分子中的 N-糖苷键 和 磷酸酯键 都可被水解。（一） 核酸的酸解n 糖苷键和磷酸酯键都能被酸水解，n 水解的难易顺序为：磷酸酯键 糖苷键嘧啶碱的糖苷键 嘌呤碱的糖苷键嘌呤与脱氧核糖之间的糖苷键最易水解。n 如， DNA在 pH 1.6于 37 对水透析即可完全除去嘌呤碱，。n 嘧啶糖苷键的水解常需要较高的温度。用甲酸（ 98 -100%）密封加热至 175 2h， 无论 RNA或 DNA都可以完全水解，产生嘌呤和嘧啶碱。（二） 核酸的碱解n常用的碱有 NaOH、 KOH等，主要水解磷酸酯键。以 KOH效果最好。nRNA较易被碱水解。n例如，在 0.3-1 mol/L NaOH溶液中，在室温至370C条件下 RNA几乎可以完全水解，生成 2- 或3- 核苷酸 ，还可能有少量的核苷、 2,5- 或3,5- 核苷二磷酸 。nDNA在较难被碱水解。nDNA在 1 mol/L NaOH溶液中，加温至 1000C， 4个小时也可得到小分子的 寡聚脱氧核苷酸 。n这种水解性能上的差别，与 RNA核糖基上 2- OH参与作用有很大的关系。在 RNA水解时， 2- OH首先进攻磷酸基，在断开磷酯键的同时形成环状磷酸二酯，再在碱的作用形成水解产物。（三）核酸的酶解核糖核酸酶 T2（ RNase T2 ）。 这个酶的来源同 RNase T1， 主要作用点为 Ap残基，可以将 tRNA完全降解成 3-腺苷酸结尾的寡核苷酸。牛脾核糖核酸酶的作用位点核糖核酸酶 T1的作用位点链球菌脱氧核糖核酸酶，是一个内切酶，作用于 DNA产物为 5-磷酸为末端的碎片，其长度不一。限制性内切酶，在细菌中发现有这类酶，主要是降解外源的 DNA。 具有很严格的碱基序列专一性，是基因工程最重要的工具酶。三、核酸的紫外吸收n 在核酸分子中，由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系，使碱基、核苷、核苷酸和核酸在 240-290nm之间有强吸收峰，在 260nm左右有最大吸收峰。可以作为核酸及其组分定性和定量测定的依据。n 对于纯的 DNA或 RNA， 可测定 A260双螺旋 DNA含量（ g/mL ） =A26050单链 DNA含量（ g/mL ） =A26040 寡核苷酸含量（ g/mL ） =A26020 纯度的判断：测定 A260/ A280的比值，纯 DNA比值 1.8纯 RNA比值 2.0有时核酸溶液的紫外吸收以摩尔磷的吸光度来表示，摩尔磷即相当于摩尔核苷酸。据此先测定核酸溶液中的磷含量及紫外吸收值，然后求出 摩尔磷吸光系数 （ P） 。增色效应 当双链核酸变性转变为单链核酸时，其在 260nm的紫外吸收值增加， （P） 值也升高，这种现象称为增色效应。减色效应 当单链核酸复性转变为双链核酸时，其在 260nm的紫外吸收值减少， （P） 值也降低，这种现象称为减色效应。四核酸的变性、复性与杂交（一） 核酸的变性（ denaturation）核酸的变性 指核酸双螺旋区的碱基之间的氢键断裂，变成单链的过程。n 能够引起核酸变性的因素很多。温度升高、酸碱度改变、甲醛和尿素等的存在均可引起核酸的变性。n RNA本身只有局部的双螺旋区，所以变性行为所引起的性质变化没有 DNA那样明显。n 利用紫外吸收的变化，可以检测核酸变性的情况。因为天然状态的 DNA在完全变性后，紫外吸收(260 nm)值增加 25 40%.而 RNA变性后，约增加1.1%。n A260值增加n 粘度下降n 浮力密度增大n 分子量不变DNA变性后的表现DNA的热 变性和解链温度（ Tm）n 用加热的方法使核酸变性叫做 热变性。n DNA的变性过程是突变性的，它在很窄的温度区间内完成。因此， 通常把加热变性使 DNA的双螺旋结构失去一半时的温度称为 DNA熔解温度或熔点，用 Tm 表示。 一般 DNA的 Tm值在 82-95C之间。RNA的 T m值tRNA的 T m值 DNATm的影响因素： （ 1） DNA的均一性。 均质 DNA， 如一些病毒 DNA， 人工合成的 poly(A-T)、 poly(G-C) 的熔解过程发生在一个较小的温度范围内；异质 DNA的熔解过程发生在一个较宽的温度范围内。 Tm大小可反映出 DNA的均一性。（ 2） G-C的含量。 G-C的含量高， Tm值高 。因而测定 Tm值，可反映 DNA分子中 G、 C含量，可通过经验公式计算：（ G+C)%=(Tm-69.3)2.44（ 3） 介质中的离子强度。 Tm与介质中离子强度有关，一般来说，在离子强度低的介质中， DNA的 Tm值较低， 熔解的范围较宽。在离子强度高的介质中， DNA的 Tm值较高， 熔解的范围较窄。 DNA的保存应在含盐的缓冲液中RNA的变性（二）核酸的复性n 变性 DNA在适当的条件下 ，两条彼此分开的单链可以重新缔合成为双螺旋结构，这一过程称为 复性 。 DNA复性后，一系列物理、化学性质将得到恢复。 DNA复性的程度、速率与复性过程的条件有关。n 将热变性的 DNA骤然冷却至低温时， DNA不可能复性。 但是将变性的 DNA缓慢冷却时，可以复性，这一过程也叫退火（ annealing)。 分子量越大复性越难。浓度越大，复性越容易。此外， DNA的复性也与它本身的组成和结构有关。n 复性反应的速度用 Cot1/2表示。 Co为变性 DNA复性时的浓度， t为时间，以秒表示。DNA复性（三）核酸的杂交 （ hybridization）n 热变性的 DNA单链，在复性时并不一定与同源 DNA互补链形成双螺旋结构，它也可以与在某些区域有互补序列的异源 DNA单链形成双螺旋结构。n 这样形成的新分子称为杂交 DNA分子。 DNA单链与互补的 RNA链之间也可以发生杂交。n 核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具有重要意义。n Southern blotting(Southern 印迹 )n Northern blotting(Northern 印迹 )n Western blotting(Western 印迹 )第 15章 核酸的研究方法一、核酸的分离、提纯和定量（一 ） DNA的分离1、染色体 DNA与碱性蛋白（组蛋白）结合成的核蛋白（ DNP） 沉淀真核细胞破碎1mol/L氯化钠提取稀释至 0.14mol/L加水饱和的苯酚，振荡冷冻离心水相（含 D