液相色谱基础

HPLC Business DeptShimadzu Corporation液相色谱基础知识SHIMADZU HPLC Business DeptShimadzu Corporation 液相色谱：以液体作为流动相的色谱分离方法v 适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分析v 流动相具有运载样品分子和选择性分离的双重作用 气相色谱：以气体作为流动相的色谱分离方法v 适用于沸点较低、热稳定性好的中小分子化合物的分析v 流动相只起运载样品分子的能力液相色谱基础知识液相色谱基础知识HPLC Business DeptShimadzu Corporation一、色谱起源石油醚碳酸钙颗粒色素玻璃柱液相色谱基础知识液相色谱基础知识HPLC Business DeptShimadzu Corporation二、定义色谱法：利用组分在两相之间分配系数不同而进行分离的技术移动相：携带样品流过整个系统的流体固定相：静止不动的一相，通常为色谱柱固 定液液相色谱基础知识液相色谱基础知识HPLC Business DeptShimadzu Corporation液相色谱基础知识液相色谱基础知识 反相液相色谱反相液相色谱流动相极性大于固定相极性流动相极性大于固定相极性能溶于水能溶于水 /有机混合物的中性或非离子化合物有机混合物的中性或非离子化合物 正相液相色谱正相液相色谱流动相极性小于固定相极性流动相极性小于固定相极性不溶于水不溶于水 /有机混合液的亲脂样品、异构体混有机混合液的亲脂样品、异构体混合物和制备合物和制备 HPLCHPLC Business DeptShimadzu Corporation液相色谱基础知识液相色谱基础知识 采用 “ HPLC” 级溶剂 避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂 对试样有适宜的溶解度 溶剂粘度要小 与检测器相匹配流动相的选择流动相的选择HPLC Business DeptShimadzu Corporation溶 剂 等 级 水的等级 纯化水 蒸馏水 去离子水波长 (nm)纯化水去离子水因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高纯化水中去除了无机和有机的污染物吸光率吸光率HPLC Business DeptShimadzu Corporation水 / 甲醇梯度ODS 柱鬼峰Gradient Curve1ml/min, 0-100% MeOHover 10 mins and hold for15 mins.溶 剂 等 级鬼峰的出现鬼峰的出现HPLC Business DeptShimadzu Corporation溶 剂 等 级 溶剂的等级 HPLC级 优级纯 分析纯都 经过蒸馏和 0.45u的过滤 (除纤维毛 ,未溶解的机械颗粒优级纯的纯度比分析纯大 ,但里面含有防腐剂和抗氧化剂HPLC级经过 0.2u的过滤 ,且除去有紫外吸收的杂质微量分析、梯度洗脱微量分析、梯度洗脱HPLC Business DeptShimadzu Corporation甲醇 乙睛 正己烷分析纯级 (实线）和 HPLC 级 溶剂（虚线）的吸光度比较溶 剂 等 级HPLC Business DeptShimadzu CorporationGeneral Maintenance and Troubleshooting缓冲液的使用 使用前必须过滤 使用后一定要对柱子进行清洗 ，以免造成腐蚀、磨损及 阻塞 :首先用纯水冲洗 30-60min（ 0.1-0.5ml/min）， 再用甲醇冲洗 30min(0.1-0.5ml/min) 易受到细菌和霉菌的影响 溶 剂 等 级注意冲洗次序，不能直接用有机溶剂冲洗HPLC Business DeptShimadzu Corporation 过滤： 0.45um或更小孔径滤膜目的：除去溶剂中的微小物理颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是在使用无机盐配制的缓冲液的时候必须过滤 脱气：除去在流动相中溶解或彼此混合而产生的气泡 气泡对测定的影响：1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形3）检测器中的气泡产生基线波动无在线脱气应注意：1）每天脱气2）如使用氦脱气，对混合溶剂脱气时间不能过 长溶 剂 前 处 理HPLC Business DeptShimadzu Corporation岛津 VP系列输液泵目的 单元 流速范围 特性和应用分析 LC-10ADVP 0.001-9.999 无脉动 ，适于半微量 LC 和 LC-MS LC-10ATVP 0.001-9.999 非凡的耐用性 ，适于常量分析*所有单元都既可做高压梯度又可做低压梯度液相色谱基础知识液相色谱基础知识HPLC Business DeptShimadzu CorporationLC-10ATvp泵：串联式往复泵LC-10ADvp泵：并联式微体积往复泵LC-10ADVP / LC-10ATVP工作原理HPLC Business DeptShimadzu Corporation单向阀结构抛光面透明塑料垫片宝石球单向阀原理吸液冲程 排液冲程出口单向阀进口单向阀泵头LC-10ADVP / LC-10ATVP工作原理HPLC Business DeptShimadzu Corporation液相色谱基础知识液相色谱基础知识梯度洗脱形式：梯度洗脱形式：v线性梯度：在梯度洗脱时，流动相强度的变化和时间成线性比例v指数梯度：在梯度洗脱时，流动相强度随时间的变化呈指数关系v折线梯度：在梯度洗脱时，流动相强度随时间的变化呈跳跃关系梯度洗脱装置：梯度洗脱装置：v高压梯度：用两台高压输液泵将两种溶剂输入v低压梯度：在常压下将两种溶剂（或多元溶剂）混合，然后用高压输液泵将流动相输入到色谱柱中。HPLC Business DeptShimadzu Corporation梯度洗脱形式的选择梯度洗脱形式的选择HPLC Business DeptShimadzu Corporation液相色谱基础知识液相色谱基础知识梯度洗脱：梯度洗脱：优点：可提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和提高分离精度，提高检测器的灵敏度注意事项：注意事项：v溶剂的纯度要高，否则梯度洗脱的重现性差v梯度混合的溶剂互溶性要好v梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器（如紫外吸收检测器或荧光检测器），而不能使用对流动相组成变化敏感的通用型检测器（如示差折光检测器）HPLC Business DeptShimadzu Corporation1. 使用适宜的流动相溶解样品在溶剂选择的时候，应注意以下原则：- 减少溶剂峰，尤其是不可使用组分峰靠近溶剂峰 的流动相- 保证样品在流动相中的溶解度，避免样品在系统中尤其在色谱柱中产生沉淀2. 进样前最好使用 0.45um 的膜 进行过滤如果样品很脏，要使用 0.2um的膜进行过滤样样 品品 处处 理理HPLC Business DeptShimadzu Corporation进样器 自动 进样器（ SIL-10A/SIL-10Ai/SIL-10ADvp） 手动进样器原理：（ 六通阀 ）注入方式：1）全量注入2）部分注入液相色谱基础知识液相色谱基础知识HPLC Business DeptShimadzu Corporation进样量和检测器响应的关系示意图Volume of Injection Response of DetectorHalf volumeof sample loopThree times volumeof sample loopLoop injectionPartialinjection液相色谱基础知识液相色谱基础知识HPLC Business DeptShimadzu Corporation手动进样器的原理图装填状态液相色谱基础知识液相色谱基础知识进样状态HPLC Business DeptShimadzu Corporation交叉污染的原因交叉污染的原因微量注射器红色表示残留样品HPLC Business DeptShimadzu Corporation手动进样法手动进样法 普通方法1.在进样状态下清洗针口2.在装填状态下插入微量注射器3.注入样品4.切到进样状态HPLC Business DeptShimadzu Corporation手 动进样 法便捷方法1.进样状态下插入微量注射器2.切到装填状态3.注入样品4.切回到进样状态HPLC Business DeptShimadzu Corporation柱温箱 分析结果重现性好 提高柱效 降低柱压 保证检测稳定性 液相色谱基础知识液相色谱基础知识HPLC Business DeptShimadzu Corporationv 柱压低于 150 kgf/cm2v 柱温在 40 左右，最高使用温度为 50v 缓冲液 PH使用范围为 2 7ODS柱的使用注意点：柱的使用注意点：硅胶在硅胶在 PH为为 3 4时稳定性最好时稳定性最好碱浓度越低，流动相含水量越低，硅胶越稳定碱浓度越低，流动相含水量越低，硅胶越稳定 。液相色谱基础知识液相色谱基础知识HPLC Business DeptShimadzu Corporation液相色谱基础知识液相色谱基础知识色谱柱的类型及适用范围硅胶基底 聚合物基底pH 范围 2 - 7 宽范围有机溶剂 所有 有限制压力 150 kgf/cm2 低压温度 宽范围 60CHPLC Business DeptShimadzu Corporation分 析 柱 的 维 护1. 在 使用新柱之前，最好用强溶剂如甲醇在低流量下 (0.2-0.3 ml