第二章_生物制品的制备

第二章 生物制品的制备（ Preparation）第一节 一般生物制品的制备方法 (Preparation of general bio-preparate )一、生物制品原料的选择、预处理与保存方法 （ Selection、 pretreatment and preservation of raw material of biopreparate） （ 1）原料选择原料的选择原则 ： 有效成分含量高，新鲜； 原料来源丰富，产地较近； 原料中杂质含量少； 原料成本低等。原料的选择注意事项： 植物原料生长的季节性； 微生物原料的对数期； 动物原料的年龄与性别 。（ 2）原料的预处理与保存： 动物原料 ： 采集后要立即处理，去除结缔组织、脂肪组织等，并迅速冷冻贮存 。 植物原料 ： 要择时采集并就地去除不用的部分，保鲜处理； 微生物原料 ： 要及时将菌细胞与培养液分开，进行保鲜处理 。 原料的保存方法主要有 ： 冷冻法 。 该方法适用于所有生物原料。常用 -40 速 冻 。 有机溶剂脱水法 。 常用的有机溶剂是丙酮。该法适用于原料少而价值高、有机溶剂对活性物质没有破坏作用的原料，如脑垂体等 。 防腐剂保鲜 。 常用乙醇、苯酚等。该法适用于液体原料，如发酵液、提取液等。 二、生物制品的提取（ extraction）(1)生物组织与细胞的破碎 （ obtrude of tissue and cell）： 生物制品大部分存在于生物组织或细胞中，要提高提取率，破碎过程是非常重要的。常用的破碎方法： 磨切法 ， 该法属于机械破碎方法，设备有组织捣碎机、胶体磨、匀浆器、匀质机、球磨机、乳钵等 。 压力法 ， 有加压、减压、渗透压三种 反复冻融法 ， 设备简便，活性保持好，但用时较长 。 超声波振荡破碎法 ， 该方法破碎效果较好，但由于局部发热，对活性有损失。 自溶法或酶解法 ， 用得较少 。（ 2）提取（ extraction）生物组织与细胞破碎后要立即进行提取。提取时，首先要根据活性物质的性质， 选择提取试剂 。 提取试剂主要有：水、缓冲溶液、盐溶液、乙醇、其他有机溶剂（如氯仿、丙酮等）。 考虑提取溶剂的 用量 及提取 次数 、提取时间 。 注意提取的 温度 、 pH、 变性剂 等因素。 三、蛋白质类制品的分离纯化方法 （Isolation and depuration of protein production） 包括蛋白质、多肽和酶类等药物。分离纯化方法有： (1)沉淀法 （ precipitation）： 蛋白质、酶的初步纯化往往用沉淀法。原理是使蛋白质胶体颗粒破坏，从而沉淀蛋白质。常用的有盐析法（ salting out）、 有机溶剂沉淀法（ organic solvent precipitation）、 等电点沉淀法（ isoelectric precipitation）、 与靶物质结合沉淀法（如抗体 抗原）（ target banding precipitation） 等。 蛋白质中性盐 中和电荷水化层减弱溶解度下降，沉淀盐析法原理等电点沉淀法在等电点时，蛋白质分子以两性离子形式存在，其分子净电荷为零 (即正负电荷相等 )，此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥，分子相互之间的作用力减弱，其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀，所以蛋白质在等电点时，其溶解度最小，最易形成沉淀物。(2) 按分子大小分离的方法 ： 有 超滤法 （ultrafiltration） 和 透折法 （ dialysis）（ 即膜分离方法） 、凝胶层析法 （ gel chromatography）、 超速离心法 （ ultra centrifugation转速大于 20 000r/min） 等。其中膜分离法可用于生物大分子物质的浓缩、分级和脱盐。 凝胶层析又称分子筛层析，主要根据混合物中分子的大小和形状不同 ，在通过凝胶时，分子的扩散速率各异而达到分离的目的。凝胶颗粒具有多孔性网状结构，小分子易进入凝胶网孔，流程长而移动速度慢，而大分子物质不能进入凝胶网孔，沿凝胶颗粒间隙流动，流程短移动快。这种现象称为分子筛效应。(3)按分子所带电荷进行分离的方法氨基酸、多肽、蛋白质、酶均为两性电解质。它们具有 等电点 ， 在离开等电点的 pH时便会带正或负电荷。例如某蛋白质等电点为 7.0，当溶液 pH为4.0时，分子则带有正电荷。由于具有该性质，利用带电性质进行分离是极其有效的方法。利用电学性质进行分离的方法有 离子交换柱层析法 （ion-exchange chromatography）、 电泳法 （electrophoresis）、 等电聚焦法 （ isoelectric focusing） 等。（ 4）亲和层析法（ affinity chromatography）大部分生物活性物质都有其作用的靶物质，如酶与底物（或抑制剂）、抗原与抗体、激素与受体等，它们之间有特异的亲合作用，利用该性质设计的特异层析分离技术称为亲和层析。亲和层析 分离专一性强，操作简便，是当前应用很广泛的分离方法之一。亲和色谱（ affinity chromatography） 1） 基本概念（ basic concept）亲和层析 是利用待分离物质与其特异性配基之间 特异性的亲和力 进行分离的一类特殊的层析技术。配基（ ligand） ： 被固定在基质上的分子称为配基，配基和基质是以共价键结合的。基质（ matrix）： 亦称为载体（ vector）， 是构成固定相的骨架 。2）亲和层析有如下特点 （Characteristics of Affinity Chromatography） 纯化 过程简单 、迅速； 分离 效率 高； 产物 纯度 高； 必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析条件。 因此应用范围受到一定的限制。3）亲和层析的基本原理（ Mechanism of Affinity Chromatography） 亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为 固定相吸附剂 。 当含有混合组份的样品（流动相）通过此固定相时，只有和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结合，其它没有亲和力的无关组份就随流动相流出。 然后改变流动相成份，将结合的亲和物洗脱下来。（见 Fig1、 Fig2） 。（ Fig1. Mechanism of AC）（ Fig2. Mechanism of AC）抗原专一抗体基质具有特异性亲和作用的生物分子4）配基的种类 (sorts of ligand)抗原与抗体。DNA与互补 DNA或 RNA（ cDNA、mRNA)。酶与其底物。激素与其受体。维生素与结合蛋白。糖蛋白与植物凝集素。5）亲和层析载体的性质与选择亲和层析载体的选择 （ selection of vectors）多孔的立体网状结构，能使被亲和吸附的大分子自由通过。颗粒均匀，具有良好的流速。具有惰性，尽量减少非专一性吸附。在温和的条件下 能与配基共价偶联。6）常用的亲和层析载体（ Vectors of Affinity Chromatography）纤维素（ cellulose）葡聚糖凝胶（ Sephadex）琼脂糖凝胶（ Sepharose）聚丙烯酰胺凝胶（ Bio-gel）多孔玻璃珠（ Bio-Glass）其它新型载体（ Other gels）7） 亲和层析配基的选择 （ Selection of ligand）1.纯化对象和配基之间必须有较强的亲和力。2.但亲和力太高也是有害的，因为在解离配 基复合物时所 需的条件就要强烈，这样可能使生物分子变性。3.配基必须具有适当的化学基团，可用于和载体相连，同时又不影响配基与生物分子之间的亲和力。8）载体、配基、目的物的连接（ Conjunction of vector、 ligand and target material） 载体（ Vectors or Matrix）+ 配基（ Ligand）+ 目的物（ target material）Fig AC relies upon a reversible highly specific binding reaction.Fig Spacer arm principleA spacer is sometimes used to ensure full accessibility of the affinity ligand.Fig