实验五、pcr基因扩增

PCR基因扩增一、实验目的l 通过本实验学习 PCR反应的基本原理与实验技术二、实验原理l PCR是一种由 引物介导的选择性体外扩增 DNA的方法，由美国人 B.Mullis于 1983年发明l 包括三个基本步骤 : 变性（ Denature） ：目的双链 DNA片段在 94 下解链 退火（ Anneal） ：两种寡核苷酸引物在适当温度（ 50 左右）下与模板上的目的序列通过氢键配对 延伸（ Extension） ：在 Taq DNA聚合酶合成 DNA的最适温度下，以目的 DNA为模板进行合成l 由这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的 DNA扩增一倍，这些经合成产生的 DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经 25 35轮循环就可使 DNA扩增达106 倍5 353Double stranded DNA templateRegion to be amplified5 353Design primers withthis sequence informationIdentical to this sequenceReverse complement of this sequenceDouble stranded DNA template5 353PCR Cycle 1PrimersTaqTaqDouble stranded DNA template5533PCR Cycle 1 Denaturation 95 strands separate PrimersTaqTaqTaq polymerase is thermostable3553Annealing55 Primers bindTaqTaqForward primer anneals to lower strandReverse primer anneals to upper strandPCR Cycle 13553Annealing55 Taq bindsTaq TaqPCR Cycle 13553Extension72 Taq copies DNA strand dNTPsTaqTaqTaq synthesises DNA in the 5 to 3 direction PCR Cycle 13553 TaqTaqTaq synthesises DNA in the 5 to 3 directionPCR Cycle 1Extension72 Taq copies DNA strand dNTPs3553 TaqTaqTaq synthesises DNA in the 5 to 3 directionPCR Cycle 1Extension72 Taq copies DNA strand dNTPs3553Taq synthesises DNA in the 5 to 3 directionPCR Cycle 1TaqTaqExtension72 Taq copies DNA strand dNTPs3553535 3End cycle 1 PCR CYCLE 1355355 33PCR Cycle 2Denaturation95strands separate355355 33Annealing55 Primers bindPCR Cycle 2Extension72 Taq copies DNA strandPCR Cycle 2Two single strandsof correct lengthPCR Cycle 2 End cycle 2 End cycle 3 End cycle 4 l Following n cycles of PCR there will be No(1+Y)n copies No initial number of targets Y efficiency of PCR reaction n cycle number1、 PCR反应中的主要成份l 引物l dNTPl Mg2+l 模板l Taq DNA聚合酶l 反应缓冲液 引物l PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定l 引物设计和选择目的 DNA序列区域时遵循下列原则： 引物长度约为 16 30bp 引物中 G+C含量通常为 40% 60%，可按 Tm 4(G+C)+2(A+T)粗略估计引物的解链温度 四种碱基应随机分布，在 3端不存在连续 3个 G或 C，因这样易导致错误引发 引物 3端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应，以减少由于密码子摆动产生的不配对 在引物内，尤其在 3端应不存在二级结构 两引物之间尤其在 3端不能互补，以防出现引物二聚体，减少产量 引物 5端对扩增特异性影响不大，可引入酶切位点或突变位点 引物不与模板结合位点以外的序列互补 简并引物应选用简并程度低的密码子l 引物的浓度一般为 0.1 0.5mol/L，引物浓度偏高会引起错配和非特异性产物扩增，引物浓度偏低则降低产量dNTPl dNTP常用的浓度为 20 200mol/，而且 4种 dNTP的终浓度相等，以减少合成中由于某种 dNTP的不足而出现的错误掺入l dNTP浓度过高虽可加快反应速度，但会增加碱基的错误掺入率，同时会抑制 Taq DNA聚合酶的反应活性；适当的低浓度会提高反应的精确度l 注意协调 Mg2+浓度和 dNTP浓度之间的关系Mg2+l Mg2+浓度会影响 Taq DNA聚合酶的活性、真实性，影响引物退火、解链温度，影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等l 通常 Mg2+浓度范围为 0.5 2mmol/Ll 在 PCR反应混合物中，应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团，例如磷酸基团或 EDTA等可能影响 Mg2+浓度的物质，以保证最适 Mg2+浓度模板l PCR反应必须以 DNA为模板进行扩增，单链分子、双链分子、线状分子或环状分子均可以作为模板 DNA （线状分子比环状分子的扩增效果稍好）l 模板的数量和纯度均会影响 PCR结果：一般反应中的模板数量为 102 105 个拷贝。模板拷贝数过多可能会增加非特异性产物l 模板 DNA中的杂质也会影响 PCR的效率Taq DNA聚合酶l 早期 PCR扩增是由大肠杆菌 DNA聚合酶 Klenow片段完成，但这种酶不耐热，所以每一轮循环在变性和退火后必须加入新酶l 后来引入耐热的 Taq DNA聚合酶，一般 Taq DNA聚合酶活性半衰期为92.5 130min， 95 40min， 97 5min，因此 PCR中变性温度不宜超过95 l Taq DNA聚合酶的最适温度是 72 ，连续保温 30min仍具有相当的活性，一次加酶可满足 PCR反应全过程的需要l 纯化的 Taq DNA聚合酶有 53 外切 酶 活性，而无 35 外切 酶 活性，不具有 Klenow酶 的 35 校 对 活性，因此在 PCR中有 错误掺 入率，大约 是每 2104个核苷酸中有一个， 在利用 PCR克隆和 进 行序列分析 时 尤为 注意l Taq DNA聚合酶的酶活性单位定义为 74 下， 30min掺入 10nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量。 在 100L反 应 体系中， 1.5 2U的 Taq DNA聚合酶 就足以 进 行 30轮 循 环l 使用 Taq DNA聚合 酶 浓 度 过 高，可引起非特异性 产 物的 扩 增， 浓 度 过低 则扩 增 产 物量减少反应缓冲液l 一般含 100mmol/L TrisCl （ 20 下 pH8.3-8.8） , 500mmol/L KCl和 0. 1的明胶，有时候还有适当浓度的 Mg2+l TrisCl是一种双极性离子缓冲液，主要靠其调节 pH，使 Taq DNA聚合酶的作用环境维持偏碱性l KCl有利于引物的退火，但浓度过高会抑制 Taq DNA聚合酶的活性l