PCR检验技术PPT课件

PCR (Polymerase Chain Reaction)检验技术第一节 概述一 . 何为 PCR？PCR聚合酶链反应 英文全称 polymerase chain reaction 简称为 PCR第一节 概述二 PCR的基本原理PCR聚合酶链反应实际上是一种快速的特定 DNA 片断在体外扩增技术。简单的说： DNA的特性三步曲 : 高温变性 低温退火中温延伸通过一个热循环仪（ DNA扩增仪）将特异片断的基因(DNA.又叫模板 DNA） 在短时间内，经过引物 Taq酶和三磷酸脱氧核苷酸（ dNTPs） 等作用后，放大到几百万倍。最后得到能肉眼看到的 DNA区带或可定量分析的 DNA量。第一节 概述三 简单复习一下 DNA的结构与复制生命是由蛋白质合成的蛋白质是由无数氨基酸连接成肽链而合成的氨基酸则是由无数个基因即 DNA组成的 这就是说 DNA是蛋白质的生命第一节 概述DNA的基本构成单位： 脱氧核糖 核苷酸 磷酸核苷酸有 4种碱基：A 腺嘌呤T 胸腺嘧啶G 鸟嘌呤C 胞嘧啶第一节 概述DNA的基本构成单位：C-胞嘧啶 ( G)A-腺嘌呤 (T)T-胸腺嘧啶 ( A)G-鸟嘌呤 (C)脱氧核糖磷酸氢键第一节 概述DNA的基本构成单位：在 DNA结构中， 4种碱基，以 A T、 G C 进行严格配对的。A T、 G C排列顺序的变化是无穷无尽的。人体中大约有 30亿（ 3X109） DNA的基因组。 碱基的顺序是 DNA的生命。第一节 概述RNA与 DNA的区别： RNA的核糖是不脱氧的五碳糖 RNA的 4种碱基是 A.U.G.CA 腺嘌呤U 尿嘧啶G 鸟嘌呤C 胞嘧啶U在 DNA中对应的碱基是 T（ 胸腺嘧啶）第一节 概述RNA与 DNA的区别：核糖 脱氧核糖第一节 概述碱基以 3个 为 1组（三联密码）DNA ATG AAG AGT GTC CAT CAC TAAmRNA AUG AAG AGU GUC CAU CAC UAA蛋白质 甲硫氨酸 赖氨酸 丝氨酸 缬氨酸 组氨酸 组氨酸 无意义ATG（ AUG）： 起始密码，是转译的开始TAA（ UAA）： 终止密码，是使 1条肽链的合成到此中止。CAT（ CAC） 简并密码，是一种氨基酸，可以有多于CAU（ CAC） 1个的三联密码，但也是特定的。 第一节 概述DNA与蛋白质合成的关系用 Watson和 Crick的中心法则说明则是：转录 翻译DNA mRNA 蛋白质逆转录第一节 概述DNA与蛋白质合成的关系先由在细胞核中的 DNA（ 基因）的碱基以 3个为一组（三联密码）转录成 mRNA的三联密码mRNA来到细胞核外的核糖体（蛋白质合成的场所）上，且每一种三联密码指使一种特定的氨基酸同毗邻的氨基酸连接起来，变成了一种肽链（蛋白质）。这个过程称为转译。如果合成的肽链很长的话，也可以形成立体结构的蛋白质。第一节 概述DNA的结构：DNA大分子以反向互补的两条单链形成双螺旋的立体结构。其形状多少有点象人们常见的小食品 “麻花 ”。第一节 概述 DNA的复制 半保留复制DNA的复制过程先是两个链分开，然后两条亲代链均以各自为模板，复制另一条互补链，之后再形成子 1代的双螺旋结构，继之再以同样的方式复制成子 2代、子 3代、子 4代 。此时把这种复制方式称为半保留复制。第一节 概述基因突变：基因突变，也就是碱基的突变。例如。 ATG编码是甲硫氨酸，但如果发生了基因突变，是 ATG中的 T变成了 A， 则三联密码变成了 AAG， 在新合成的蛋白质长链上与甲硫氨酸对应的位置上就只能是赖氨酸，而不再是甲硫氨酸了。这就是突变的本质。有时人体就因此发生病变。这也就是 “突变 ”的主要实质。第一节 概述四 扩增 HBVC基因片断为例简述 PCR原理HBV病毒是带有 3182个碱基的双螺旋的双链 DNA步骤 1 前处理2 基因扩增3 电泳4 检测报告第一节 概述基因扩增模板 DNAHBV病毒 950C 变性：使双链打开，变成两个单链，二个单链 是实验成败的关键550C 退火：在合成原料 d NTPs.Mg2+的作用下，模板 DNA与引物 C 构成二条杂交链 ,二条杂交链决定其实验的特异性720C延伸：在 Taq酶的作用下，以引物为起点，开始 DNA链延伸反应，使链延长。形成一条新的链 对实验的特异性和产量有关！生成二个特异性的 DNA片断，完成了第一次循环生成的二个特异性的 DNA片断，继续进行下一次循环，经过 25-30次循环，模板 DNA得到了大量的复制。 HBV-C可扩增到几百万倍。第一节 概述理论上讲， DNA的产量是指数方式增加，即 n次循环后，扩增产物拷贝数为 r=2n但是应该指出，扩增产物的指数式增加不是无限制进行的。在 PCR反应后期，由于引物和底物的消耗， Taq酶活力下降等因素的影响，扩增产物的增加逐渐由指数形式变为线性形式。所以实际上进行 30个循环后，扩增倍数一般可达 106-107。如果想提高扩增产物的产量，可将产物 DNA样品稀释 1000-10000倍后，作为新的模板再进行第二轮PCR扩增。第一节 概述 PCR 循环 - Step 1 - 热变性第一节 概述 PCR 循环 - Step 2 - 引物对（ Primer Pair） 退火结合到靶序列第一节 概述 PCR 循环 - Step 3 - Taq DNA 聚合酶催化引物延伸第一节 概述 第一个 PCR 循环结束 - 产生靶序列的两个拷贝（ Copies）第一节 概述 靶序列扩增第一节 概述上述的扩增是在 PCR扩增仪上进行的。然后将扩增产物经过 EB电泳，最后在紫外透射仪上进行鉴定、定量分析。第一节 概述第一节 概述报告方式定性 : PCR HBV-DNA +PCR HBV-DNA -定量 : PCR HBV-DNA 1.00X103copies/ml PCR HBV-DNA 1.00X103copies/ml 第一节 概述第一节 概述第一节 概述五 PCR技术的特点（一）特异性高1. 以探测基因为目标。属于 “病因诊断 ”，针对性强。对多种传染病，根据 PCR检测结果可以确诊。2. 在感染性疾病的基因诊断中，不仅可以检出正在生长的病原体，也可检出潜伏期的病原体。既可确定既往感染，也可确定现行感染。尤其对那些目前尚不能体外培养或难于培养的病原体（梅毒螺旋体、结核杆菌、乙肝病毒等）采用 PCR检查来确定感染就特别有效。PCR检测的靶样品是病原体的核酸，与生物化学和免疫学检查相比， PCR结果与病原体分离培养结果更为一致，直接反应病原体的存在与否。 第一节 概述（二）灵敏度高在 PCR扩增中，模板 DNA以指数级迅速增加，样品中极其微量的靶序列在数小时内即可增加上百万倍，因此检