结核病的实验室诊断技术及应用ppt课件

结核病实验室诊断技术及应用,1,全球范围内结核病疫情急剧恶化 全球1/3人口（约20亿）已感染了结核菌， 人口的大规模流动 结核病与艾滋病同时流行 结核菌耐多药菌株的出现我国是世界上仅低于印度和印尼的第三结核病大国 患病率高， 新发患者93万/年，结核菌感染率为约40 死亡率高，每年死亡人数达13万 耐药率高早期快速诊断与治疗成为制约结核病防控的关键因素 常规结核病实验室检测方法诊断阳性率不到60。 摘自2014年中国结核病监测报告,2,结核病检测技术发展历程,灵敏度低检测周期长成本低,交叉污染仪器要求复杂反应抑制,高灵敏度高特异性交叉污染少,血清学检测WHO不推荐r-干扰素释放实验,结核病检测技术发展历程,3,一、细菌法 直接涂片（阳性率低5000以上细菌/ml；不能区分真假、死活）,4,一、细菌法 结核菌的培养,结核病病原学诊断的金标准 (培养时间长是其软肋),5,一、细菌学检测的新方法提高阳性率,发光二极管荧光显微镜（LED）液体培养（可同时缩短培养时间）自动化涂片/染色技术（夹层杯法）,不能区分真假、死活；培养仍是金标准但耗时长、,6,分枝杆菌固体培养与液体培养比较,液体培养在提高阳性率、缩短报阳时间上均优于固体培养。,吴学兵，陆彬，桂晓虹等。液体MGIT培养法在结核分枝杆菌检测中的应用评估。检验医学，2013,3（28）：211-214,仍然不能满足临床快速诊断的需要,7,二、免疫学检测,血清学检测（抗体、抗原）结核菌素试验（灵敏度、特异性？）结核感染T细胞检测（-干扰素检测）,8,WHO关于血清学检测声明,2011年7月20日，世界卫生组织（ WHO ）正式声明，要求禁止将 血清学检测方法 （抗原，抗体，蛋白芯片等）用于肺结核和肺外结核的诊断。,WHO warns against the use of inaccurate commercialserological tests for pulmonary and extra-pulmonaryTB.,蛋白质组学的发展 3、4、7种结核杆菌优势表位抗原（16KD、38KD、MPT64、ESAT-6、CFP10、Mtb8、Mtb8.4、 Mtb16.3）制备多靶点蛋白微阵列 大量的文献报道其敏感性特异性均显著高于涂片与培养法 可用于结核病的临床辅助诊断，提高痰涂片和痰培养假阴性的检测率,参考文献略,9,-干扰素释放实验（IGRAs),10,Interferon-Gamma Release Assays,10,结核杆菌特异抗原：ESAT-6与CFP10,由结核杆菌基因组RD1区相同的操纵子编码的蛋白所有的卡介苗（BCG）均丢失RD1和RD2绝大多数的环境分枝杆菌(NTM)也不存在RD1和RD2区,11,ESAT-6 : 早期抗原靶6（Early Secreted Antigenic Rarget 6）CFP10 : 培养滤液蛋白10（Culture Filtrate Protein 10）,11,12,结核杆菌特异抗原：ESAT-6与CFP10,12,准确T-SPOT临床诊断性能,特异性只针对结核分枝杆菌复合群敏感，与绝大多数环境分枝杆菌和卡介苗（BCG）无交叉反应美国FDA数据：特异性97.1%(297/306)国内临床数据：特异性94.1%(478/508) 灵敏度基本不受免疫力低下/受抑制影响，在肺外结核患者中有很高的检出率美国FDA数据：灵敏度95.6%(175/183)国内临床数据：灵敏度95.3%(624/655),13,13,T-SPOT相关指南,T-SPOT.TB是采用-干扰素释放试验（IGRA）原理，获得美国FDA认证、欧盟CE认证和首个中国CFDA认证的商业化产品列入欧美25个国家结核诊疗指南 2011年英国NICE指南、2010年美国最新结核诊疗指南、 2010年加拿大结核指南美国CDC推荐卡介苗（BCG）接种人群结核感染检测首选 国内风湿科和消化科已列入专家共识,14,14,快速T-SPOT的实验步骤,15,15,实验效果图,一个斑点=一个结核效应淋巴细胞,16,T-SPOT结果的解读-阳性结果,活动性结核病 典型结核中毒症状 影像学支持 排除其他诊断MTB感染状态 典型结核中毒症状 未发现结核患病证据,潜伏性结核感染 无结核中毒症状 无其它结核患病证据陈旧性结核 无结核中毒症状 既往TB史或明确TB证据,NTM（四种）感染,高孟秋 ，-干扰素释放试验检测结果的临床意义解读，中华结核和呼吸杂志，2014,17,T-SPOT结果解读-阴性结果,除外结核感染 所用抗原为MTB特异性抗原 机体没有结核特异抗原致敏的T淋巴细胞 目前未感染结核分枝杆菌,假阴性：感染阶段不同（窗口期）少数免疫系统功能不全/基础疾病的情况，如HIV感染者、肿瘤患者、婴幼儿等特殊肺外结核：结核性脑膜炎、粟粒性结核灵敏度相对较低实验非正常操作：细胞计数不够等,高孟秋 ，-干扰素释放试验检测结果的临床意义解读，中华结核和呼吸杂志，2014,18,T-SPOT的应用,优点：使用血液标本，取样简单；可用于肺内和肺外结核检测；阴性预测值很高，可用于排除结核感染。缺点： 阳性预测值约80%，不能用于结核的确诊 不能确定是否是肺结核（肺外） 不能区分是活动性和潜伏性结核不能区分某些非结核分枝杆菌（堪萨斯、苏氏、戈登、海 分枝杆菌） 操作复杂，时间长；对于原发感染初期或免疫低下人群，可能存在假阴性。,能否疗效监测？无大量数据,19,三、结核DNA检测技术,测序金标准荧光定量 PCR环介导恒温扩增法（LAMP）基因芯片检测鉴定技术基因Xpert MTB/RIF检测技术,20,1. 荧光定量 PCR,是应用最为广泛的TB-DNA定量PCR检测方法具有灵敏度高（10CFU/ml）、特异性强、线性关系好、操作简单等优点。,21,2.环介导恒温扩增法（LAMP）,是在恒温下进行PCR扩增，因此操作更为简便，反应更加快速。65扩增40min即可用肉眼观察结果。扩增阳性标本呈现绿色荧光，反之为阴性。是结核分枝杆菌DNA检测技术的代表-灵敏、快速、特异、简捷将会极大地推动结核病的防治工作,22,DNA检测-LAMP,结果判读：显色目测或SYBR Green I等荧光染料,23,LAMP法和其他PCR法的比较,24,LAMP法在结核菌检测中的应用,临床试验, LAMP法和对照试剂（BD快速培养）对比结果,灵敏度89.54% 阳性结果预期值98.13% 特异性98.93% 阴性结果预期值93.77% 总符合率95.31%,25,26,Journal of Clinical Microbiology. 2010, 48(10): 36543660.,通量：可同时检测 16-22种常见分枝杆菌速度：6小时 灵敏度： 103 CFU/ml可自动或肉眼判读结果,3. 基因芯片检测技术,26,检测全程仅需6小时,27,同时鉴定MTC与21种NTM,28,4.Xpert MTB/RIF检测技术,29,GeneXpert应用1、