基因组DNA的提取及电泳鉴定 PPT课件

分子生物学实验,1、 欢迎大家参加分生实验的学习；2、 学习分生实验的重要性；3、 守纪律，听老师安排，穿白衣；4、 每组做一份实验4、 本课件原则上禁止拷贝，要作好记录; 5、 关于课间休息和上课时间每天实验结束应主动整理实验台。值日安排。,1,实验课考试,1. 最后2学时进行实验课考试 2. 开卷, 内容为实验课学习内容。,2,3,一、加样器的使用及注意事项 1、 用途 2、 如何使用？,2.1 根据取样量，选择合适的加样器。 5ul、50ul、500ul，应选择哪个加样器?,顶部标有加样器的最大量程，分别为：20ul: 0.5 20 l100/200ul: 20 100/200 l 1000ul: 200ul 1000 l,实验仪器的使用及注意事项,4,练习：加样器读数为 100，实际体积各为多少?,2.2 如何调节？,(1)首先观察目前读数,假设为050: 1000 l: 500 l 100/200 l: 50 l 20 l： 5 l (2)顺时针调节- 读数变小 逆时针调节- 读数变大(3)注意：调节前加样器读数正处于最大量程或最小量程时，如果向错误方向调节，马上会超出量程，将会损害加样器的精度。,5,2.3 加样器使用步骤(示教及学生练习)：1）选择加样器,观察读数,调节读数，吸头的安装要紧密。 不要用手直接拿吸头，安上吸头后一定要再固定一下。2）吸取液体前，先打到第一挡。3）将吸头插入液面下适当深度， 过深可能会腐蚀加样器, 过浅可能会吸入空气。4）缓慢松开拇指,吸取液体。松开过快，液体上冲会腐蚀加样器;完全放开拇指后，停留约半秒钟, 急于离开液面，容易吸入空气。5）抬起加样器,估计体积是否正确,将外壁液体用容器口引流回去6）(吸头内有液体时，不能将加样器倒置或平放，以防液体倒流损坏加样器！),贴容器内壁，将液体匀速打出，加样器推到第二挡。 观察吸头内液体是否完全打出并立即弃于废物盒内.,6,1、打开电源 2、离心管中的液体为2/3,盖紧盖子,防止离心机被腐蚀。,二、离心机的使用注意事项,1代表转速盘上方的数据，2代表下方的数据。,3、样品配平, 对称放入离心机(管的连接处朝外). 4、设定离心时间(如设定2分钟，可定时多点时间，再用手表记时)。 5、统一离心，逐渐升到要求转速。,7,实验一、真核细胞基因组DNA的提取、酶切及电泳,实验目的,1. 掌握人外周血基因组DNA的提取技术。 2. 学习酶切技术3. 学习DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和技术。,第一部分 ：裂解血细胞、 蛋白酶k消化第二部分: 酚氯仿抽提、 乙醇沉淀第三部分： 酶切、 DNA电泳,实验内容,（到 8：308:40）,8,1）取0.3ml抗凝血置于1.5ml Eppendorf管中.2）加入1ml STMT 溶液，充分混匀，静置5min，使其溶血。3）9,000rpm,离心 3 分钟(统一离心)。4） 弃上清。弹管底重悬沉淀。,注意:离心时离心机内样品要平衡,实验步骤,实验第一部分：裂解红细胞、蛋白酶K消化,8：409：15,STMT 溶液： S: Sugar 8% T: Triton X-100 1% M: MgCl2 0.5mM T: Tris-HCl 10mM (PH:8.0) 作用： 用Triton 细胞膜上打孔，裂解细胞。,9,4）加 0.4ml生理盐水，悬浮细胞。5） 9000rpm,离心 3分钟(统一离心)，弃上清，弹匀。,6）加460 l NE溶液，混匀。7）加30 l 10%SDS, 迅速混匀。8）加50 l 蛋白酶K(20mg/ml),混匀， 置50C水浴1小时。,操作注意事项： 1、混匀时确认沉淀已被悬起。 2、注意30ul、50ul加样体积准确。,10,作用：a. 阴离子型去污剂，溶解细胞膜、核膜上脂质成分 b.使蛋白质变性 c.将细胞膜、核膜破坏；对核酸酶有抑制作用,N: NaCl 50mME: EDTA.Na2 25mM (PH:8.0) 作用： 金属离子螯合剂，抑制DNase的活性 (螯合DNase发挥活性所需的2价阳离子)。,各种试剂的作用,1、NE 溶液：,2、SDS ：十二烷基硫酸钠 终浓度0.5%,3、蛋白酶K(或链霉蛋白酶),是广谱蛋白酶，能在SDS和EDTA的存在下保持很高的活性，降解蛋白质，将DNA游离。,11,一、核酸提取的主要步骤,课间介绍,真核细胞基因组在提取过程中一般有以下几步:1) 破碎细胞；2) 去除蛋白质，糖类等等生物大分子；由于真核细胞基因组较大，在纯化出的的操作中应注意动作轻柔，且在低温下进行，以最大限度地减少机械和化学作用对的剪切，从而获得相对完整的3) 沉淀核酸,12,乙醇沉淀,SDS裂解蛋白酶K消化,琼脂糖电泳,PCR,DNA提取步骤图解,酚氯仿抽提,13,重蒸酚: 酚的作用是变性蛋白质，而对DNA结构没有影响。 无色 酚的氧化产物(如醌等,粉红色) 破坏磷酸二脂键。 重蒸酚是将酚中的酚的氧化产物去除。TE溶液 : Tris-HCl 10mM (pH:8.0) EDTA.Na2 1mM (pH:8.0) 作用：提供略碱的pH值，保证DNA溶于水相。 在酸性条件下，DNA分配于有机相。8-羟基喹啉： 0.1% 黄色 酚相指示剂 抗氧化剂,作用： 去除蛋白等杂质。酚对蛋白有强烈的变性作用，用酚和氯仿抽提样品，可以使样品中的蛋白质变性沉淀，可通过离心去除。为防止其对后续实验的影响，一般再用氯仿抽提去除残留的酚。,1、TE饱和重蒸苯酚：,14,氯仿作用： a. 氯仿的变性作用不如酚好， 但与酚共同/交替使用可增强去蛋白效果； b. 氯仿有加速有机相和水相的分离、 去除植物色素和蔗糖、抑制核酸酶活性；,2、酚/氯仿,3、氯仿/异戊醇 ( 24 : 1),氯仿的作用： 去除DNA水溶液中残留的微量酚。异戊醇的作用：减少操作过程中气泡的产生。,15,在单价阳离子存在的情况下，乙醇可以使DNA发生沉淀。可离心收集 .核酸是多聚阴阳离子的水溶性化合物，能与很多阳离子形成盐类而沉淀，在许多种有机溶剂中不溶解，也不会被变性。最常用沉淀剂为1价钠、钾、胺和锂等离子的盐类，如醋酸钠、NaCl、氯化锂、氯化钾等常用有机沉淀剂有：乙醇、异丙醇、聚乙二醇、精胺等。,5、无水乙醇 ：,作用：提供单价阳离子。,4、醋酸钠：3M NaAc pH: 5.2,16,课间休息,同学自己练习：,加样器使用提示： （1）吸头的安装要紧密。 （2）打到第一挡，将吸头插入液面下适当深度（3）缓慢松开拇指，吸取液体。拇指完全放开后，吸头在液面下停留一下（约半秒钟）（4）将外壁液体用容器口引流回容器。吸头内的体积应大致正确。（5）贴目的容器内壁，将液体匀速打到目的容器内，加样器推到第二挡。观察吸头内液体是否完全打出。,十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。 蛋白酶K,再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得总DNA溶液。,10:00上课,17,1、加入550ul(等体积)TE饱和酚, 混匀1min. 10,000rpm, 2 min。 (注意抽取下层酚相; 酚可腐蚀加样器等, 加样器头用过即弃掉) (轻柔混匀，避免DNA链断裂; 但是太轻又起不到变性蛋白的作用) 2、将上层水相移至一新管中 (要尽量抽尽，又不可吸起酚相)。 加入500ul(等体积)酚/氯仿 (已经配好，体积比1:1), 同上条件混匀、离心。3、 将上层水相移至一新管中。 加入500ul(等体积)氯仿-异戊醇，同上条件离心、取上清。4、加入1/10体积（约30ul）醋酸钠于上清中充分混匀。 加入2-2.5倍体积无水乙醇（约1ml） （通常加满小离心管）， 混匀后交给老师，（统一置）-20 1 h ( 或-70 10 min)。,实验第二部分、 酚氯仿抽提DNA及乙醇沉淀,18,乙醇沉淀后午休。,注意事项：1） 本实验将用到的TE饱和重蒸苯酚、氯仿/异戊醇是有机试剂，比水的比重大，而DNA溶解在水里，我们总是取上清。2） 在抽取完苯酚、氯仿等有机试剂，不能将加样器平放或倒置，以防液体导流损坏加样器，加完样后立即弃掉加样器头。3）基因组DNA由于太大，非常容易受机械剪切而断裂，因此，为了得到完整的基因组DNA，尽量不要多次进行物理性操作。,19,7、加入13 l 双蒸水, 溶解沉淀，-20保存。,6、10,000 r/min 离心 5 min，弃上清。,8 l： 酶切、电泳,余 5 l ：PCR模板（下次课进行）。,一定要充分溶解沉淀,20,8、基因组DNA的酶切： 基因组DNA 8 ul 10x Buffer H 1 ul EcoR I(最后加入) 0.6 ul 置 37 保温 45 min。,实验第三部分：基因组DNA的酶切,1:002:20,21,课间介绍（2）：1. 酶切相关知识,1、酶活性单位 Unit （U）： 1U: 是指在1小时内，适当温度下(37C)，在50ul 反应体系中，将1ug of lambda DNA(底物DNA)完全消化所需的酶量。 2、酶切体系： 10反应缓冲液：提供内切酶反应最适 pH值及所需离子。 双蒸水：无细菌和其他酶类污染。 BSA ：100-200ug/ml，保护酶蛋白不失活。 内切酶：含50%甘油，-20保存。 反应体积：一般根据底物DNA的量来计算。反应体系中甘油浓度应5%。,22,1. Southern blot DNA水平基因结构分析的重要策略之一. 基因组DNA酶切电泳后可以直接用于Southern blot 转膜。 2.构建基因组文库3.PCR的模板 克隆表达基因 分析基因一级结构的变化 基因组PCR产物的酶切电泳可以分析基因多态性； 利用内参法可以相对定量分析特定基因在基因组上的拷贝数。,课间介绍 提取模板DNA的常见目的：,基因组DNA的链很长，常用的蛋白酶K酚抽提法由于机械剪切力的作用，很难获得完整的DNA分子, 可获得100kb-150kb大小的DNA片断，可满足下述实验用途。,23,DNA琼脂糖凝胶电泳,1. 内切酶消化后的DNA片段,琼脂糖凝胶,取下硝酸纤维素膜,标记探针,杂交袋,4. 将硝酸纤维素膜放入杂交袋中, 预杂交; 杂交:与标记的核酸探针; 洗膜,放射自显影后的X光底片,将硝酸纤维素膜与X-光片曝光,2. 变性 中和3. 转膜,5. 放射自显影或显色,Southern Blot 基本过程,24,实验第四部分、 DNA质量检测 琼脂糖电泳,一、 原理,DNA分子在 pH 8.0 的电泳环境中，带负电荷，在一定强度电场力的作用下，从负极向正极迁移。 电泳样品载体琼脂糖是一种线性多糖聚合物，煮沸冷却后形成网格样结构，电泳中起分子筛作用。通常情况下，分子量大的DNA电泳过程中由于受到的阻力较大，泳动速率较慢，反之，分子量较小的DNA片段跑在前面。,25,二、 常用试剂,上样液成份： 10.25%溴酚蓝或/和0.25%二甲苯青（样品指示剂） 240%蔗糖 或 30% 甘油（增加样品比重），利于加样。电泳缓冲液： TAE 为例 T: Tris碱 A: 冰醋酸 E: EDTA 提供有一定缓冲能力的pH值(8.0), EDTA可抑制DNase 的作用。 溴化乙锭（EB）：染色剂 一种荧光染料，分子呈扁平型，可嵌入到DNA或RNA 的碱基之间。在紫外光激发下能发出红色的荧光。,致癌剂,26,1% 琼脂糖凝胶电泳。 在样品中加 23ul 6上样液，混匀， 加入上样孔内 电泳条件： 100110伏，30-40分钟。 电泳结束后照像保存，结果分析。,三、 实验操作,80分钟。（2:203:40),27,线性DNA片断大小（kb） 琼脂糖浓度（%） 5 60 0.4 0.8 10 0.7 0.4 6 1.0 0.2 4 1.5 0.2 3 1.75 0.1 3 2.0,凝胶的浓度不合适时电泳会出现什么现象？,四、 琼脂糖凝胶的浓度,28,五、 电泳仪的使用方法,稳压: 电流旋钮调到最大，再根据需要调节电压。 如箭头所示。,29,用内切酶酶切基因组，电泳结果可出现连续