需氧和兼性厌氧球菌的鉴定ppt课件

,微生物学检验,第 七 章 需氧和兼性厌氧球菌鉴定,返回总目录,本 章 内 容,学习目标及重点,学习目标： 1.掌握：葡萄球菌属、链球菌属、肠球菌属和奈瑟菌属的主要生物学特性和微生物学检验，尤其是它们的鉴定依据和鉴别要点2.熟悉葡萄球菌属、链球菌属、肠球菌属和奈瑟菌属的临床意义本章重点： 1.葡萄球菌属、链球菌属、肠球菌属和奈瑟菌属的主要生物学特性和微生物学检验2.葡萄球菌属、链球菌属、肠球菌属和奈瑟菌属的临床意义,概述,球菌的种类很多，根据革兰染色性不同分为革兰阳性和革兰阴性球菌。,致病性球菌称病原性球菌主要引起化脓性炎症又可称为化脓性球菌,第一节 葡萄球菌属,葡萄球菌属细菌为一类触酶阳性的革兰染色阳性球菌，因常堆聚成葡萄串状而得名。广泛分布于自然界并构成人体的正常菌群。大多非致病，有少部分引起化脓性感染。主要包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、溶血性葡萄球菌等35个种，17个亚种,一、生物学特性 1.形态与染色 本属菌多为球形，直径0515um。葡萄球菌无鞭毛，无芽胞、无荚膜 （1）在液体培养基上：呈单个、成双或短链状排列 （2）在固体培养基上：呈葡萄串状排列 （3）脓汁标本中：呈单个散在或少数呈葡萄串状排列,第一节 葡萄球菌属,金黄色葡萄球菌（脓汁）镜下形态,金黄色葡萄球菌纯培养镜下形态,第一节 葡萄球菌属,2.培养特性 营养要求不高，在普通营养琼脂（普皿）上生长良好。在20%CO2中有利于毒素形成 （1）在液体培养基：呈均匀混浊生长 （2）在普皿上：形成12mm、圆形、光滑、边缘整齐、不透明、有色菌落。不同菌株产生不同的脂溶性色素，如：金黄色、白色、柠檬色,金黄色葡萄球菌金黄色脂溶性色素,第一节 葡萄球菌属,表皮葡萄球菌在普通琼脂平皿上的白色色素,表皮葡萄球菌在血平板上的白色色素,2.培养特性,第一节 葡萄球菌属,（3）在血皿上 金黄色葡萄球菌和溶血性葡萄球菌，能产生溶血毒素，在血平板上产生-溶血。其他葡萄球菌无此现象,金黄色葡萄球菌在血平板上24h菌落,2.培养特性,（4）在高盐甘露醇平板上：大多数葡萄球菌耐盐性强（10%15%g/L NaCl培养基中生长）。此平板常作为选择性培养基，菌可分解甘露醇使指示剂呈淡黄色。G-菌在此平板上不生长,金黄色葡萄球菌在高盐甘露醇平板上的淡黄色菌落,2.培养特性,第一节 葡萄球菌属,第一节 葡萄球菌属,（5）卵黄高盐琼脂平板：金黄色葡萄球菌产生卵磷脂酶，在此培养基上，菌落周围可形成白色沉淀环。表皮葡萄球菌亦可生长，但无白色沉淀环。,2.培养特性,金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌在卵黄平板上生长现象,第一节 葡萄球菌属,3.生化反应：葡萄球菌的生化活性强，能分解多种糖类，蛋白质和氨基酸，触酶阳性。,触酶阳性,阴性对照,发酵葡萄糖,第一节 葡萄球菌属,4.细胞壁抗原 主要类型有下列两种,第一节 葡萄球菌属,5. 分类 葡萄球菌属可根据DNA的同源性、色素、生化反应及是否产生凝固酶等不同方法进行分类。,6.抵抗力 葡萄球菌是抵抗力最强的无芽胞细菌。,*根据是否产生凝固酶分,凝固酶阳性凝固酶阴性,葡萄球菌,二、临床意义,第一节 葡萄球菌属,第一节 葡萄球菌属,微生物检验程序,标本,脓汁，血液，剩余食物，呕吐物等,直接涂片镜检,革兰阳性球菌,分离培养,生长现象,色素、溶血,鉴定,毒素测定,药物敏感试验,生化反应：血浆凝固酶、甘露醇、耐热核酸酶,幼猫试验,报告,形态染色：革兰阳性球菌,第一节 葡萄球菌属,1.标本：主要有血液、尿液、痰液、脑脊液、穿刺液和浓液等。,三、微生物学检验,2.直接涂片：标本或增菌液直接涂片，革兰染色镜检见革兰阳性呈葡萄串状排列球菌，即可做出 “查见革兰阳性球菌，葡萄串状排列，疑为葡萄球菌”的初步报告。,第一节 葡萄球菌属,3. 增菌培养 血液标本增菌培养，24h培养后每日观察增菌液变化。如无变化，需培养7d，其中盲目传代2次，如无细菌培养可报“血液标本经7d培养无菌生长”。如发生混浊、内有胶胨样凝块等现象可进行进一步分离培养和革兰染色,4.分离培养（1）血平板：351824h （2）高盐甘露醇平板或高盐卵黄平板(*进行葡萄球菌菌落特征复习),第一节 葡萄球菌属,5.生化反应： （1）触酶试验：阳性。,（2）凝固酶试验：玻片法和试管法。,第一节 葡萄球菌属,5.生化反应 （3）耐热DNA试验,表皮葡萄球菌耐热DNA试验 (-)性,金黄色葡萄球菌耐热DNA试验 (+)性,第一节 葡萄球菌属,5.生化反应,阳性反应 阴性反应,Slidex Staph Plus可快速鉴定金黄色葡萄球菌,（4）乳胶凝集试验,此试验不仅可检测金黄色葡萄球菌凝固酶，还可检测葡萄球菌A蛋白（SPA）,第一节 葡萄球菌属,第一节 葡萄球菌属,5.生化反应,（6）肠毒素试验：现多采用免疫学方法快速检测肠毒素，主要以ELISA为主。,（7）其他鉴定试验：临床上常用商品化鉴定系统如 API葡萄球菌鉴定试剂盒。,API STAPH可鉴定试剂盒,（5）甘露醇发酵试验：金黄色葡萄球菌阳性。,第一节 葡萄球菌属,5.生化反应（8）其它非培养鉴定或检查方法： 1）免疫学方法：用ELISA或对流免疫电泳方法检测金黄色葡萄球菌磷壁酸抗体 2）分子生物学方法：用商品化Accu探针对培养物进行鉴定，用脉冲场凝胶电泳法（PFGE）对葡萄球菌的质粒和染色体进行限制性核酸内切酶分析等,第一节 葡萄球菌属,6.药敏试验,（1）药敏鉴别试验-新生霉素敏感试验,金黄色葡萄球菌 S 表皮葡萄球菌 S 腐生葡萄球菌 R,第一节 葡萄球菌属,6.药敏试验,（2）药敏试验（临床上按CLSI选择抗菌药物进行试验）,第一节 葡萄球菌属,（3）耐甲氧西林的葡萄球菌药敏试验,MRSA和非MRSA,第一节 葡萄球菌属,7.鉴定 按科属种的顺序 （1）科间鉴别,微球菌科、链球菌科和奈瑟菌科鉴别要点,第一节 葡萄球菌属,7.鉴定 按科属种的顺序,（2）属间鉴别,葡萄球菌属与微球菌属鉴别要点,第一节 葡萄球菌属,d:不定,（3）种间鉴别,引起临床感染的最常见的5种葡萄球菌鉴别要点,第一节 葡萄球菌属,返回章内容,第一节 葡萄球菌属,第二节 链球菌属,链球菌属细菌为一类触酶阴性的革兰染色阳性球菌，广泛分布于自然界、人及动物肠道和健康人鼻咽部,链球菌在光镜下形态（革兰染色）,链球菌在电镜下形态,1.形态与染色 G+球菌，直径0.51um （1）液体培养基中链状排列，长短不一。短由48个菌组成，长者可达2030个细菌组成 （2）在固体培养基或脓汁标本中，呈短链、成双或单个散在排列,一、生物学特性,A群链球菌,肺炎链球菌,B群链球菌,第二节 链球菌属,链球菌幼龄时可见荚膜，继续培养荚膜消失 肺炎链球菌常常呈双排列，故又称为肺炎双球菌。在动物体内它可形成较厚的荚膜 链球菌属无鞭毛、无芽胞,肺炎链球菌荚膜,第二节 链球菌属,2.培养特性 营养要求高，在5%10%CO2环境下生长更好,（1）液体培养基（血清肉汤）：沉淀生长（上清液澄清/微混）,（2）血平板：菌落小，灰白色，半透明，不同菌种的溶血现象不同，有-溶血、-溶血和-溶血（不溶血）,-溶血 -溶血 -溶血,第二节 链球菌属,3.生化反应 生化活性较活跃：触酶阴性，葡萄糖+，菊糖,（1）A群链球菌：杆菌肽 S,A、B和D群链球菌杆菌肽试验,A群杆菌肽 S,第二节 链球菌属,3. 生化反应,（2）B群链球菌：CAMP+，马尿酸钠+,（3）D群链球菌：PYR+，七叶苷+,B群CAMP+,D群链球菌七叶苷+（上）A群链球菌七叶苷-（下）,思考：CAMP原理？,第二节 链球菌属,3. 生化反应,（4）肺炎链球菌：Optochin S，胆汁溶菌+，菊糖+,肺炎链球菌Optochin S,胆汁溶菌（平板法）,胆汁溶菌（试管法）,第二节 链球菌属,4.分类 根据下述链球菌的溶血特征和Lancefield血清学等传统的分类法，目前仍然是临床实验室鉴定链球菌的常规使用方法。,（1）根据培养基上溶血特性分类：,第二节 链球菌属,（2）根据抗原结构分类：链球菌Ag结构较复杂，含多种抗原，主要有：,链球菌Ag群中，对人类致病者90%属A群，B、C、D、F、G群也常感染致化脓性疾患。,第二节 链球菌属,（4）综合溶血性、抵抗力、生化反应性状分类,（3）根据链球菌对氧的需求 分为三类：需氧、厌氧、微需氧链球菌,第二节 链球菌属,二、临床意义,第二节 链球菌属,溶血毒素O：耐热，含-SH基的蛋白质，对氧敏感，易被氧化成-S-S，失去溶血能力 溶血毒素S：多肽，分子量少，对氧稳定，血平板上的溶血现象由它引起 检测抗“O”抗体，可辅助诊断链球菌性疾病如风湿热及链球菌感染后的肾小球肾炎,第二节 链球菌属,第二节 链球菌属,微生物检验程序,标本,血液、尿液、创伤标本、脓性分泌物等,直接涂片镜检,分离培养,*注意与葡萄球菌属、肠球菌属鉴别，链球菌分群,鉴定,生长现象,溶血类型,生化反应：触酶、PYR、七叶苷、菊糖、胆汁溶菌等,形态染色：革兰阳性球菌,药敏试验,报告,血清学试验,抗“O”试验,Lancefield分群,第二节 链球菌属,1. 标本采集：标本类型有血液、尿液、创伤标本、脓性分泌物等,三、微生物学检验,2.直接涂片：标本或增菌液直接涂片，革兰染色镜检见革兰阳性呈链状排列球菌，或见革兰阳性矛头状球菌成双排列，菌体周围有透明环，即可做出 “查见革兰阳性球菌，链状排列，疑为链球菌”；或“查见革兰阳性矛头状球菌，成双排列，疑为肺炎链球菌”的初步报告,第二节 链球菌属,三、微生物学检验,3增菌培养：下列生长现象有助于区别不同链球菌,一般菌培养7天，无现象则要盲目传代2次亚急性细菌性心内膜炎血培养4周，每周移种平板一次。如有生长，转种血琼脂平板,第二节 链球菌属,4.分离培养 培养条件：需加血清、血液等营养物质。,需氧、厌氧各一块培养经37培养12天。观察菌落特征、溶血现象。,注意要点,培养条件,培养基,溶血性检查,初代分离应置510的CO2环境下，可用二氧化碳孵箱或烛缸。,血平板羊血平板：有助于其溶血特征的识别和进一步鉴定。,A群链球菌大多产生溶血毒素“S”，一般链球菌只产生溶血毒素“O”。,第二节 链球菌属,5鉴定实验 链球菌属细菌的鉴定应根据其菌体形态、菌落形态和溶血特征，结合以下鉴定试验进行。,（1）与其他革兰氏阳性球菌鉴别：,检查溶血毒素“O”时，要降低氧分压如厌氧培养，倾注倒板或穿刺接种，这样可使只产生溶血毒素“O”的链球菌也表现出-溶血现象,第二节 链球菌属,5鉴定实验,（2）属内鉴定： 1）分类（复习） 2）生化反应 3）多糖抗原分群（群特异性抗原）,Lancefield 分群试剂盒,第二节 链球菌属,Lancefield血清学凝集试验,第二节 链球菌属,甲型溶血性链球菌和丙型链球菌鉴定到肺炎链球菌、D群链球菌，其他的统称为草绿色链球菌。,乙型溶血性链球菌鉴定到抗原群（A、B、C、G）。,1类：乙型溶血性链球菌：A、B、C、D、F、G群,第二节 链球菌属,青霉素 6.5%NaCL肉汤生长 D群链球菌 S - 肠球菌 R +,3类：其它草绿色溶血性链球菌,2类：胆汁七叶苷水解阳性 鸟链：Q群+，其它D群+,第二节 链球菌属,（3）其他鉴定试验 1）链激酶 A群+ 2）牛乳美蓝试验 粪链、乳链不被抑制 3）马尿酸钠水解试验 B群+ 4）肺炎链球菌 荚膜肿胀试验+,抗“O”试验,原理：中和试验方法：间接凝集结果：效价大于400单位意义：风湿热及其活动性的辅助诊断,6.血清学诊断,第二节 链球菌属,链球菌侵入体内产生SLO，刺激机体产生相应抗体ASO，当两者中和后，在加入SLO乳胶试剂，因病人血清中ASO量很多，未被中和掉的抗体ASO与乳胶试剂反应，产生清晰凝集，为抗“O”试验阳性；无凝集，为阴性。,7. 药敏试验 （1）药敏鉴别试验 （2）药敏试验,抗“O”试验原理,返回章内容,第二节 链球菌属,第三节 肠球菌属,肠球菌属原属于链球菌D群（血清学分类），1984年从链球菌属分离出，成为独立的菌属，广泛分布在自然界，是人类、动物肠道和女性生殖道的正常菌群，既往认为肠球菌对人类无致病作用，但近年研究已证实了肠球菌是需氧和兼性厌氧球菌中仅次于葡萄球菌的重要医院内感染致病菌，多见于尿路感染、腹腔感染和菌血症,一、生物学特性,1.形态与染色 G+球菌，呈单、成双或短链状排列。无芽胞，无荚膜，无鞭毛,2.培养特性 营养要求高，某些菌株在选择性培养基如麦康凯平板上可生长。在高盐（6.5%NaCl）、碱性（pH9.6）、高胆汁（40%）培养基上能生长。在10和45均能生长,肠球菌血平板24小时培养物镜下染色,第三节 肠球菌属,一、生物学特性,在血琼脂平板上经35培养1824h后，可形成灰白色、直径0.51.0mm大小的圆形、不透明、表面光滑的菌落，不溶血或-溶血，少数出现-溶血,不同菌株的肠球菌在血平板上生长现象,不溶血,-溶血,第三节 肠球菌属,3.生化反应 触酶-、多种糖+ ，胆汁七叶苷试验+、PYR试验+,4.抵抗力 弱，是天然耐药菌株，对氨基糖苷类、万古霉素、替考拉宁耐药呈获得性耐药,5.分类 肠球菌属归类链球菌科，在Lancefield血清分类上属于D群。临床标本分离的多属于肠球菌属群，分离率最高的是粪肠球菌，其次是屎肠球菌,胆汁七叶苷试验肠球菌阳性，阴性对照,第三节 肠球菌属,二、临床意义,。,第三节 肠球菌属,微生物检验程序,标本,血液、尿液、创伤标本、脓性分泌物等,直接涂片镜检,分离培养,鉴定,生长现象,溶血类型、温度生长试验,生化反应：触酶、PYR、胆汁七叶苷、6.5%NaCl,形态染色：革兰阳性球菌，短链状排列,药敏试验,报告,Lancefield分群,第三节 肠球菌属,1. 标本采集：根据临床症状及体征采集标本，标本类型有血液、尿液、创伤标本、脓性分泌物等,三、微生物学检验,2.直接涂片：形态与染色 脓性标本、创伤标本或增菌液直接涂片，革兰染色镜检见革兰阳性呈单、成双或短链状排列球菌，做出“查见革兰阳性球菌”的初步报告,第三节 肠球菌属,三、微生物学检验,3.增菌培养：24h培养后，每日观察增菌液变化。如无变化，培养至7d。如发生混浊生长现象可进一步转种，进行分离培养,4.分离培养 （1）血平板：3518-24h （2）选择性培养基 叠氮钠胆汁七叶苷平板 麦康凯（MAC）平板,肠球菌在MAC上生长现象,第三节 肠球菌属,6. 血清学试验 Lancefield分群属D群,5.生化反应,7.药敏试验 根据CLSI选择抗菌药物,返回章内容,第三节 肠球菌属,奈瑟菌属是一群专性需氧革兰阴性球菌，奈瑟菌属中对人致病的只有脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌，引起流行性脑脊髓膜炎和性病淋病。,第四节 奈瑟菌属,奈瑟菌电镜下形态,一、生物学特性,脑膜炎奈瑟菌,淋病奈瑟菌,1. 形态与染色,G双球菌,G双球菌,革兰染色,美兰染色,第四节 奈瑟菌属,脑膜炎奈瑟菌,淋病奈瑟菌,2. 培养特性,营养要求高,营养要求高，初次培养需供给510%CO2及湿润的环境才能生长。,最适生长温度35 37， 40均不能生长培养时间过长，本菌可产生自溶酶,最适生长温度3537。37均不能生长,巧克力平板血平板卵黄双抗平板（EPV）血清肉汤,MNYC平板T-M平板（国外常用）巧克力平板血平板卵黄双抗平板（EPV）血清肉汤,第四节 奈瑟菌属,巧克力平板上的脑膜炎奈瑟菌,MNYC上的淋病奈瑟菌,2.培养特性 奈瑟菌菌落,第四节 奈瑟菌属,脑膜炎奈瑟菌,淋病奈瑟菌,3. 生化反应,（1）氧化酶和触酶试验 + +,氧化酶试验（平板法）,触酶试验（试管法）,第四节 奈瑟菌属,脑膜炎奈瑟菌 淋病奈瑟菌,3. 生化反应,（2）糖分解试验,葡萄糖 麦芽糖 乳糖 蔗糖 指示剂：酚红, , ,脑膜炎奈瑟菌,淋病奈瑟菌,葡萄糖+、麦芽糖+、蔗糖-、乳糖-，其他糖-，蛋白质-。,葡萄糖+、麦芽糖-、蔗糖-、乳糖-，其他糖-。,第四节 奈瑟菌属,脑膜炎奈瑟菌,淋病奈瑟菌,4. 抗原结构与分类,根据荚膜多糖抗原分为13个血清群。较重要的是A、B、C、W-135和Y群。我国流行的菌株以A群为主。,抗原：菌毛、外膜蛋白、LPS、H8蛋白分解酶、主要铁调节蛋白等。分型：表型分类法、A/S分类法（自学为主）,弱。对温度极为敏感，对青霉素敏感。,5. 抵抗力,弱。对温度极为敏感，对各种消毒剂敏感。,第四节 奈瑟菌属,二、临床意义,第四节 奈瑟菌属,单纯淋病（男） 单纯淋病（女）,2.所致疾病,新生儿淋球菌性结膜炎,淋球菌性眼结膜炎（脓漏眼）,第四节 奈瑟菌属,三、微生物学检验,第四节 奈瑟菌属,（1）标本采集 根据临床症状和体征不同采集不同标本，如血液、瘀斑渗出液、脑脊液、鼻咽分泌物。,1. 脑膜炎奈瑟菌微生物学检验,第四节 奈瑟菌属,（2）直接涂片，染色镜检：脑脊液离心沉淀涂片，或刺破瘀斑血或组织液印片，革兰染色镜检，发现中性粒细胞内、外革兰阴性双球菌，呈肾形成双排列，可做出“查见革兰阴性球菌”的初步报告,（3）增菌培养：血液或脑脊液先在葡萄肉汤增菌，24h培养后每日观察增菌液变化。如无变化，培养至第7d。如发生混浊生长现象可转种巧克力平板进行分离培养,第四节 奈瑟菌属,（4）分离培养：其他标本直接分离于血琼脂平板、巧克力平板或EPV平板，置5%10% CO2环境中，经3537培养18h24h后观察菌落特征,（5）鉴定：,推测性鉴定：主要根据选择性和非选择性培养基上菌落特征、结合涂片中的菌体形态，氧化酶+、触酶+,第四节 奈瑟菌属,脑膜炎奈瑟菌A群单价血清凝集试验左侧为阳性反应，右侧生理盐水对照,确定性鉴定：通过糖发酵试验和菌群凝集试验，再参考普通琼脂上不生长，血琼脂平板放置22 不生长等特点作出确定性鉴定。,第四节 奈瑟菌属,青霉素 S、利福平 S、