STX石房蛤毒素及其来源

,石房蛤毒素群与其来源,STXs and their origins,报告人 郑耀洋,导师 江天久,1.介绍1.1 几个常见词语的辨析1.2 PSP的症状与毒素作用机理1.3 STXs的结构与分类2.STXs的来源2.1 STXs与藻类2.2 STXs与细菌2.3 STXs与双壳贝类2.4 STXs与其他动物2.5 STXs与TTX2.6 有毒生物中毒素累积的假说,1.介绍,PSP,PSTs,STX,SPFP,paralytic shellfish poisoning。指症状或引起这类症状的毒素。,paralytic shellfish toxins。指引起这类症状的毒素。,saxitoxin，石房蛤毒素。,saxitoxins，结构类似于石房蛤毒素的一个毒素群，20种以上。,1.1 几个常见词语的辨析,STXs,saxitoxin puffer fish poisoning，由河豚鱼体内的STXs引起的中毒，与河豚毒素中毒相区别。,1.2 PSP的症状与毒素作用机理,症状,先通过口腔粘膜进入人体, 嘴唇周围产生麻木感并逐渐传至脸、颈部、四肢，肌肉无力，晕眩感，共济失调，嗜睡，呼吸无力。在高剂量时因呼吸麻痹而死亡。,作用机理,活性部位为7、8、9位的胍基。与可兴奋细胞膜上的电压门控钠离子通道的氨基酸残基高亲和。通过选择性阻断Na+粒子内流而阻碍动作电位的形成。,1.3 STXs的结构与分类,图1 STX的结构式,活性部位,表1 STXs的分类,脱氧脱氨甲酰基类 deoxydecarbamoyl,2.STXs的来源,2.1 STXs与藻类,图2 STX的合成（John A, et al. 2010）,Shimizu等发现Saxitoxim是由精氨酸、来源于甲硫氨酸的甲基、醋酸酯合成的：,可以产生STXs的藻类：,甲藻,蓝藻,表2 产生STXs的各种藻类与各种藻产生毒素的类型 （Jonathan R. Deeds et al. 2008）,1）Alexandrium catenella 2）Alexandrium tamarense3） Cochlodinium polykrikoides 4）Gymnodinium catenatum 5） Pyrodinium bahamense,1,3,4,5,2,图3 部分产生STXs的甲藻,1,2,3,1）Anabaena circinalis 2）Aphanizomenon gracile 3） Cylindrospermopsis raciborskii,图4 部分产生STXs的蓝藻,2.2 STXs与细菌,对于同一种藻种在不同的地理位置产生的毒性不同这个现象，Silva最早提出假说，认为甲藻产生的毒素是由于内共生细菌的存在。Kodama等发现在没有产生有毒甲藻藻华时，贝类中的STX的毒性也会上升。,图5 在Ofunato Bay扇贝毒力与塔玛亚历山大藻细胞数量的关系 （Kodama et al. 1990）,Kodama等用生物鉴定法、电泳分析法、TLC、HPLC证明了从一种甲藻(Protogonyaulax tamarensis)培养中分离出来的细菌(Moraxella sp.)能分泌STX。（ Moraxella sp.后来又被归于Pseudomonas/Alteromonas） 。包括Silva在内的一些研究者都声称利用电镜观察到了产毒甲藻中的细菌。,图6 荧光HPLC分析发现分离得的细菌毒素与STX行为相似（Kodama et al. 1988）,Kodama等用抗产毒菌(Moraxella sp.)的抗体与产毒甲藻（ A.tamarense ）反应，发现当甲藻的残体破裂时可以观察到加剧的交叉反应。这说明产毒的共生菌可能存在于残体中。,图7 Western Blot法用抗Moraxella sp.抗体分别对Moraxella sp.和A.tamarense进行蛋白分析（Kodama. 2010）A：对Moraxella sp.提取物 B：对A.tamarense提取物左：用PBS提取 右：用含SDS的缓冲液,图8 在原生动物中的细胞吞噬过程,一般而言，造成宿主感染的细菌会被宿主的防御机制清除。然而，某些细菌能逃避宿主的防御机制并在宿主细胞中生存下去。,Tracie R等分析了从两种甲藻（Alexandrium tamarense和A. minutum)中分离出来的两株细菌产生的分泌物，证明其中某种原先认为是GTX4的物质事实是另一种非毒素物质。给内共生产毒假说提出了挑战。但从目前看来，内共生产毒假说仍然是比较有竞争力的学说。,Sakamoto等利用分子筛技术，在链状亚历山大藻藻华期间发现在贝类毒性较强时，在包含藻细胞的颗粒部分没有发现大量的毒素。HPLC分析表明，毒性强的部分存在与于比链状亚历山大藻更小的颗粒。通过质谱分析发现这部分含有纯度很高的STXs。表明一种更小的生物体也产生STXs，并且在藻华中与链状亚历山大藻同时发生。Levasseur等用HPLC测了在加拿大的圣劳伦斯河口的细菌的STXs的生产潜力，发现有4株细菌STX阳性。这4株细菌是从目前没有发生PSP的区域取得的，其中3个区域没有发生藻华的过往历史。Levasseur等也检测了不同大小的颗粒部分中的毒素水平与在不同尺寸颗粒培养基中异养的生物在无光环境下的毒素生产，虽然某些部分颗粒没有毒性，但是绝大部分大小的颗粒在无光培养时都有新的STX合成。,这说明能生产STX的细菌也能自由生活并且广泛存在于自然界中。,细菌,细菌,藻类,产生STXs,2.3 STXs与双壳贝类,双壳类是造成PSP中毒的载体，是STXs的主要载体，。在双壳贝类滤食的过程中，有毒藻细胞和孢子首先被运送到食道和胃里，然后在胃里发生消化作用，PSP 毒素被释放出来，进入其他消化器官。研究发现，不同种贝类对 PSP 的累积和排出情况差别很大。Andrinolo等根据贝类的解毒动力学，把双壳贝类分为慢速解毒者和快/中速解毒者,Andrinolo等根据贝类的解毒动力学，把双壳类贝类分为慢速解毒者和快/中速解毒者。,表3 以贝类排毒速度为依据的贝类分类 （Andrinolo et al. 1999）,1,4,3,2,1）Perna Viridis 2）Crassostrea gigas3） Saxidomus giganteus 4）Patinopecten yessoensis,图9 部分STXs载体贝类,证据表明，甲藻中的STXs通过食物网进入贝体内并在其消化腺中被吸收和积累。按照这种毒性累积机制，贝类体内累积的毒性应该是摄入毒性与消除毒性之差。,贝类,STXs,STXs,STXs,STXs,带毒藻,但是在很多情况下，贝类体内的毒素并不能完全用上述机制解释。Ogata等发现在大船渡湾的塔玛亚历山大藻藻华期间虾夷扇贝 (Patinopecten yessoensis)的毒性并没有大幅度地上升，反而在高峰期之后才上升。即使直到无法检测到该藻时扇贝体内的毒性还会升高。,图10 在Ofunato Bay的Alexandrium藻华中藻细胞数与扇贝毒性关系(为藻细胞数，-为扇贝毒性)(Ogata et al. 1982),造成这种现象的原因可能包括：藻类密度不均一导致的测定误差；贝类体内STXs由相对低毒转化为更高毒的毒素种类；与海水中的细菌有关。,为了进一步确认这个现象，分析了用塔玛亚历山大藻投喂的扇贝。令人惊异的是，扇贝体内累积的毒素比扇贝食用的塔玛亚历山大藻的毒素水平更高 这些结果表明产毒细菌可能随着塔玛亚历山大藻一起被扇贝摄食，并在支囊的上皮细胞中存活一段时间。这段时间内扇贝的毒性波动变化，表明在扇贝中的毒素清除的同时，新的毒素在扇贝中合成。,细菌,贝类,STXs,STXs,STXs,带毒藻,STXs,STXs不仅被发现于甲藻及相关贝类，还被发现于其他动物中。Noguchi等人第一次揭示了STX存在于与甲藻完全无关的花纹爱洁蟹(Atergatis floridus)体内。STX又被发现于圆尾鲎(Carcinoscorpius rotundicauda)、豹纹多纪鲀(Takifugu pardalis)和几种海洋螺类体内。这些动物都不吃甲藻，体内的STXs都不是直接从甲藻中来的。,2.4 STXs与其他动物,1,1） Atergatis floridus 2） Carcinoscorpius rotundicauda 3） Takifugu pardalis,3,2,图11 其他可能带有STXs的动物,Yasumoto得出结论认为扇蟹体内的STX并不是来源于甲藻，而且该区域所有双壳类体内都没有发现STXs的存在。相反，他们在Jania sp. 中发现了STXs，扇蟹体内的STXs的来源有可能是这种藻类。一种可能性是扇蟹长期食用这种藻导致了毒素的积累。 但是Arakawa等发现扇蟹排出STXs的速度非常快，表明扇蟹体内的STXs是由于长期摄入Jania sp.而积累的说法正确的可能性并不大。,Jania rubens,图12 红藻的一种,2.5 STXs与TTX,TTX,tetrodotoxin。河豚毒素。,症状,主要临床表现为恶心、呕吐、腹泻、麻痹或刺痛感，血压下降，呼吸困难，严重者因呼吸衰竭而死亡,作用机理,TTX 通过分子內胍基与神经细胞膜钠离子通道上的羧基之间相互吸引，通过与膜上专一受体结合，阻断电压门控钠离子通道，从而阻滞动作电位阻滞神经细胞的兴奋与传导，导致与之相关的生理机能的障碍，主要造成肌肉和神经的麻痹。,TTX中毒的症状和毒素作用机理：,自然界的TTX 总是与其类似物混合在一起。除 TTX 以外，已经分离鉴定了 20 余种 TTX的类似物，这些都是引起食物中毒的成分,图13 TTX的化学结构式,为何河豚鱼会带强力毒素TTX的原因仍然是一个谜。Matsui等人揭示了当喂以无毒的河豚鱼红鳍东方鲀(Takifugu rubripes )含有TTX的饵料后，河豚鱼变成有毒的了。这表明TTX对于河豚鱼而言可以是一种外源性物质。由于河豚鱼是肉食性鱼类，它体内的TTX可能是由于食物网的作用而累积的 。虽然在河豚鱼的食谱中没有检测到大量的毒素，野生的河豚鱼仍有可能累积大量的毒素。这些事实让我们主张河豚鱼并不通过食物网来累积毒素，而是通过另一些未知的机制累积毒素。,白法螺（Charonia sauliae）通过捕食带有TTX的滤沙海星(Astropecten polyacanthus)而累积毒素。然而，这样的支持TTX的食物网累积的例子是很稀少的。在河豚食物中毒素成分分布与带毒河豚本身体内的毒素成分很少重叠，这说明河豚鱼体内的毒素不是简单地通过食物网累积机制累积的。,1,1） Charonia sauliae 2） Astropecten polyacanthus,2,图13 白法螺与滤沙海星,另一方面，Yasumoto等已经证明TTX是细菌的产物，因此河豚鱼之类的带毒动物的毒素来源被认为是细菌。Noguchi等人提出河豚鱼体内的毒素是由于其肠道细菌分泌毒素并长期地被河豚鱼吸收而累积在河豚鱼体内的。这个观点看起来很有道理，因为产TTX菌溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)在带毒河豚鱼肠道菌群中是优势种。然而，Sugita等人指出溶藻弧菌在不带毒的养殖河豚鱼红鳍东方鲀肠道中也是优势种。而且虽然肠道细菌确实会分泌毒素，但考虑到河豚对TTX的强大排出能力，肠道的毒素水平太低，不足以产生累积效应。,既然河豚通过食物网积累和通过肠道细菌积累的可能性都不大，那么还有什么解释呢？在甲藻毒素研究中使用过的方法在河豚毒素研究中也可以使用：尝试从带毒或不带毒的河豚鱼的肝脏中分离出产TTX的细菌。人们从有毒的河豚鱼样本体内分离出了这类细菌，而无法在无毒的河豚鱼样本体内分离出这种细菌。分离出来的细菌的多克隆抗体也会与分离得该细菌的肝脏组织发生反应。电子显微镜线微分析结果也支持了在肝脏细胞中存在该类细菌的看法。分离得到的细菌也显示了钠离子通道阻断的活性而且在HPLC中有与TTX相似的峰。这些发现表明带毒河豚鱼的肝脏细胞被能产生TTX或TTX相关物质的细菌感染了。,Kendo发现星点东方鲀(Takifugu niphobles)的胚胎在孵化过程中其体内的TTX含量一直在增加，这表明增加的毒素是胚胎的产物。 由此可推测河豚产生TTX的机制可能是其本身产生或和细菌共同产生。,大部分带毒的河豚鱼除了带有TTX外还带有STXs。 而且在2.3中提到的体内存在STXs的动物常常还同时存在河豚毒素。这表明，存在STXs或者TTX两者其中任何一种毒素的生物体可能同时拥有两种毒素。,STXs,TTX,Kodama等发现在产STXs的代表性物种塔玛亚历山大藻细胞中检测到相当可观的量的TTX。Kodama等还发现在塔玛亚历山大藻藻华期间，在贝类中一定量的TTX与STXs一同积累。贝类中的TTX的量与STXs的量呈平行关系，这表明贝壳中的TTX的来源也是塔玛亚历山大藻。这些事实支持了这个推论。,产生STXs的细菌广泛分布与自然生态系统中。对于产生TTX或TTX相关物质的细菌而言，这也是正确的。 会产生TTX的海藻希瓦氏菌(Shewanella alga )最近被发现也会产生STXs。这种物种广泛存在于自然界中。这个事实暗示大多数水生生物都暴露于这些细菌中。 Sato等检测了多种水生生物的内脏是否存在STXs与TTX，结果表明，虽然含量很低，所有检测过的生物体内都含有这些毒素。,表4 带有TTX或STXs毒性的一般水生生物 （Sato et al. 1993）,多种一般的生物的内脏中毒素的量的差异并不显著，这表明毒素并不是通过食物网累积的，而是因为肠道中细菌的存在而产生的。而且上面的实验中使用的所有大马哈鱼胃部都是空的，因此其内脏中的毒素并不来源于食物网。这些发现支持了能生产STXs和TTX的细菌在自然界中广泛存在的说法。,2.6 有毒生物中毒素累积的假说,如上所述，STXs与TTX的产生机制非常复杂，至今未能有能更加确定的结论。Kodama等发现TTX和STXs是从有毒扇贝消化腺中或河豚肝脏提取物经过RNA酶处理后，从无毒高分子量的物质中释放出来的。再基于前面的其他事实，提出了下面这个假说。,TTX和STXs不是细菌代谢的终产物，而是某种对细菌的生存很重要的代谢产物的中间产物。毒素相关的物质可能是RNA，而消化它的酶是在生物体中广泛存在的RNA酶。当一些宿主内的细菌被消化时，细菌体内某种毒素有关的物质（很可能是某种RNA）也一同被消化，与此同时毒素作为一种代谢物被释放出来。 有毒生物体体内可能含有特殊的、能消化外源的含STXs和/或TTX部分的RNA酶。有毒甲藻种的一些藻株是无毒的。这些甲藻体内可能缺少一种能消化外源RNA的酶。,图14 STXs与TTX产生假说（Kodama 2010）,参考文献王云峰,等;麻痹性贝毒毒素的应用研究进展J;海洋科学集刊;2003,00Jonathan R. Deeds. Non-Traditional Vectors for Paralytic Shellfish Poisoning J. Marine Drugs :2008, 6, 308-348丁君.赤潮毒素中腹泻性贝毒和麻痹性贝毒的研究及进展J. 大连水产学院学报. 2001, 16(3)John A, et al. Biosynthesis of toxic naturally-occurring seafood contaminantsJ; Toxicon 56 (2010) 244258ES Silva. Intracellular bacteria: The origin of dinoflagellate toxicityJ; Journal of Environmental Pathology, Toxicology and Oncology : Official Organ of the International Society for Environmental Toxicology and Cancer . 1990, 10(3):124-128M Kodama, et al. Possible association of marine bacteria with paralytic shellfish toxicity of bivalvesJ;Marine Ecology Progress Series. 1990 ,61, 203-206M Kodama, et al. Bacterial Production of Saxitoxin (Microbiology Aqua-BioSci. Monogr, 2010,3(1) 1-38,参考文献Tracie R, et al.GTX4imposters: characterization of fluorescent compounds synthesized by Pseudomonas stutzeri SF/PS andPseudomonas/AlteromonasPTB-1, symbionts of saxitoxin-producingAlexandriumspp. Toxicon ,2003,41,339347马菲菲, 麻痹性贝毒在贝类中的生物转化及其对机体免疫系统的影响D; 青岛:中国海洋大学,2012孟宪梅,河豚毒素免疫学检测方法的建立及三种海洋生物毒素融合单链抗体的初步研究; 吉林: 吉林大学,2010M Kodama,Occurrence of tetrodotoxin in Alexandrium tamarense, a causative dinoflagellate of paralytic shellfish poisoning; Toxicon, 1996, 34(10): 11011105K Matsumura, et al. Production of tetrodotoxin in puffer fish embryos; Environmental toxicology and pharmacology, 1998, 6, (4), 217219,图片来源.au/2009/image/865/index.php链状亚历山大藻/redtide/photos/psp?tid=542&cid=71080&c=3&idx=6&slideshow=27492塔玛亚历山大藻.au/2009/image/864/index.php链状裸甲藻/resource_weblist.cfm巴哈马梨甲藻 /labs/phytoplankton/guide/dinoflagellates/Cochlodin-Norfolk.aspx多环旋沟藻http:/www.shigen.nig.ac.jp/a