ORMDL3在哮喘发生中作用机制研究

ORMDL3 在哮喘发生中的作用及其转录调控机制研究专 业: 遗传学博士生: 邱熔芳导 师: 刘奇迹教授中文摘要哮喘是一种由环境因素和遗传因素共同作用导致的复杂疾病，其遗传率约为 36%-79%。 2007 年，对哮喘进行的第一个全基因组关联分析发现了一个新的哮喘易感基因-ORMDL3。研究者发现 ORMDL3 所在的 17q21 区域中的遗传多态位点与儿童哮喘显著相关，并且在 EB 病毒感染的哮喘儿童的淋巴母细胞系中，该区域中的遗传多态还与 ORMDL3 基因的表达水平密切相关。ORMDL3 基因位于 17q21，是 ORM 基因家族的一员。在酵母中，该家族含有 ORMDL1 和 ORMDL2 两个成员，而在人类中还有 ORMDL3-，共三个家族成员。在酵母中，该基因家族与神经鞘磷脂代谢平衡相关，是神经鞘磷脂合成过程中第一个限速酶的负调控者，提示神经鞘磷脂代谢可能在哮喘的发生过程中具有重要作用。另外，在酵母中敲除 ORM 基因，表现为生长缓慢和对有毒物质的敏感性增强，这一现象在转染入人类 ORMDL3 基因的 mRNA 后得以拯救。ORMDL3 基因编码一个含有 153 个氨基酸的内质网四次跨膜蛋白，其在人类中表达广泛，特别是在肝脏和外周血淋巴细胞中高表达。研究表明 ORMDL3 在内质网上与钙泵共定位，抑制钙泵的功能，影响钙离子平衡并且能够促进内质网应激和未折叠蛋白反应，表明 ORMDL3 可能参与与内质网有关的炎症反应。另外，人们还发现在儿童脐带血中 17q21 区域中的遗传多态不但与ORMDL3， GASMB 基因的表达水平相关，而且还与 IL-17 的分泌相关，表明该区域可能在免疫系统成熟的早期阶段与 T 细胞的发育分化有关。而除了与哮喘相关之外，人们还发现 ORMDL3 与克隆恩病，强直性脊柱炎，系统性红斑狼疮，1 型糖尿病，神经胶质瘤，原发性胆汁肝硬化，过敏性鼻炎等多种炎症性疾病显著相关。自从发现 ORMDL3 是一个新的哮喘易感基因后，在很短的时间内，人们又在多个不同种族人群中进行了验证，结果发现 ORMDL3 基因在不同人群中均与儿童哮喘显著相关。但是所有这些研究都是在儿童哮喘中进行的，那么，ORMDL3 基因是否也与成人哮喘相关呢？在 EB 病毒感染的哮喘儿童淋巴母细胞系中 17q21 上的遗传多态与 ORMDL3 基因的表达相关，那么在成人哮喘患者的外周血淋巴细胞中这一现象是否仍然存在呢？哮喘患者 ORMDL3 基因的表达异常是怎样引起的呢？ ORMDL3 基因的表达调控又是怎样的呢？带着这些问题，本论文进行了以下四个方面的研究：第一部分17q21 上的遗传多态位点区域与中国汉族成人哮喘的关联分析为了明确 ORMDL3 基因所在的 17q21 区域与成人哮喘之间的相关性，我们从山东大学齐鲁医院呼吸科收集了 710 例无亲缘关系的成人哮喘患者，以及从健康体检中心随机收集了 656 例无亲缘关系、无哮喘病及其它呼吸道疾病及过敏病史的健康体检者作为对照组。并根据相关报道及中国人群中该区域的连锁不平衡情况，我们从 17q21 区域选取了 5 个单核苷酸多态位点（SNP）：rs7216389，rs12603332， rs12936231，rs9303277， rs11557467 进行基于群体的病例对照关联分析。结果发现这 5 个 SNP 多态位点均与成人哮喘显著相关（ P0.05） ，其中两个SNP 多态位点 rs9303277，rs11557467 与成人哮喘的相关性最强（P0.001） 。带有 rs11557467 位点 G 等位基因的个体或者 rs9303277 位点 C 等位基因的个体的哮喘患病风险显著升高（OR=1.27，95% CI 1.07-1.51，P =0.006 以及 OR=1.27，95% CI 1.07-1.49，P =0.005） 。即使是在去除性别和年龄的影响以后，这种相关性仍然存在。此外，单体型分析发现，与单体型 TCCCG 相比，单体型 CTGTT 具有保护效应，OR=0.81，95% CI 0.67-0.97，P=0.02。因此，本部分研究结果表明：ORMDL3 基因所在的 17q21 区域中的遗传多态在中国汉族人群中与成人哮喘显著相关。第二部分17q21 区域导致哮喘易感的功能 SNP 的鉴定由于在 ensembl 数据库中显示 ORMDL3 基因具有 2 种转录本形式：ENST00000304046 (（ORMDL3-001) ）以及 ENST00000394169 (（ORMDL3-002 ）) ，并且这两个转录本的编码区域是完全相同的，不同的只是非翻译区，因此它们所编码的蛋白质是完全一样的。那么在人体中，ORMDL3 基因是以哪一种转录本形式存在呢？另外，Moffatt 等人的研究发现，在 EB 病毒感染的哮喘儿童的淋巴母细胞系中 17q21 区域中的遗传多态与 ORMDL3 基因的表达水平密切相关，因而提示遗传多态调节 ORMDL3 基因的表达异常很可能是在一个潜在的哮喘发病机理的发生中起着一定的作用。但是到目前为止，已经发现的该区域中与哮喘相关的 SNP 中没有一个是位于 ORMDL3 基因的编码区，而我们第一部分选取的一个 SNP 位点 rs12603332 恰好位于该基因的第一内含子中，而已有报道位于内含子中的遗传多态可能会影响特定细胞或组织中基因的转录剪接。因此，我们首先检测了 ORMDL3 基因在人体不同组织中所使用的转录本形式以及该基因第一内含子中的一个 SNP 位点 rs12603332 的不同等位基因是否影响 ORMDL3 基因 mRNA 的剪接。我们选取 rs12603332 位点基因型为 CC 及 TT 的个体各 5 例，同时选取人体肝脏组织，食管癌组织，大肠癌组织以及肺组织各 12 例，分别提取 DNA 和RNA。另外，根据两个转录本的剪接特点设计引物，用 PCR 扩增的方法进行检测：一对引物能同时扩增出 ORMDL3 的两种转录本形式，用以确定 ORMDL3 基因是否表达同时监控 cDNA 的质量，另一对引物只能扩增出第二转录本，用于检测第二转录本是否存在。结果显示，在人体外周血淋巴细胞，肝脏组织，食管癌组织，大肠癌组织以及肺组织中都只表达 ORMDL3 基因的第一转录本形式：ENST00000304046 (（ORMDL3-001) ） ，并且不论是 CC 基因型还是 TT 基因型（rs12603332 位点）的个体都只表达第一转录本。因此，rs12603332 位点并不影响 ORMDL3 基因的剪接，那么，这个区域中的遗传多态导致哮喘的机制是什么呢？哪个位点才是真正的功能位点呢？由于基因转录水平的改变是介导哮喘或其他疾病易感的一个非常重要的机制，并且基因转录丰度很可能受到某些影响改变转录因子结合的 SNP 多态位点的直接影响调控。因此，我们检测了哮喘患者和正常对照中 ORMDL3 基因和GSDMB 基因的表达情况。从山东大学齐鲁医院呼吸科收取了 61 例确诊的成人哮喘患者以及 70 例正常体检个体的新鲜外周血，提取 DNA 及 RNA，运用实时定量的方法进行等位基因差异表达分析。结果发现，哮喘患者外周血淋巴细胞中 ORMDL3 基因以及 GSDMB 基因的表达水平显著高于正常对照个体， P0.05，并且携带有 rs7216389，rs12603332 以及 rs12936231 位点危险等位基因的个体，其 ORMDL3 和 GSDMB 基因的表达水平显著升高，P 值均小于 0.05。因此，本部分研究结果表明：首先，在人体外周血淋巴细胞，肝脏组织，食管癌组织，大肠癌组织以及肺组织中，ORMDL3 基因以第一转录本的形式存在，并且该基因第一内含子中的 rs12603332 位点不同等位基因并不影响ORMDL3 基因 mRNA 的剪接。其次，成人哮喘患者外周血淋巴细胞中 ORMDL3及 GSDMB 基因的表达水平明显高于正常对照，并且 17q21 区域中与哮喘相关的遗传多态的危险等位基因能显著升高这两个基因的表达水平。因此，ORMDL3及 GSDMB 基因表达的异常很可能是该区域诱发哮喘的潜在机制。 但由于 17q21区域是一个强连锁不平衡的区域，从中筛选出具体的功能位点尚有待于更多的研究来证实。第三部分 寻找 ORMDL3 基因的基本启动子的鉴定第二部分研究结果表明，ORMDL3 基因表达的异常很可能是导致哮喘发生的原因之一，而关于该基因的转录调控机制目前尚不明确，因此在本部分研究中我们对该基因的基本启动子进行了分析。首先，我们克隆了 ORMDL3 基因转录起始点至上游约 1.5kb 的区域，连入pGL3 basic 载体中，用双荧光素酶报告基因系统分析其启动子活性。此后运用系列截短的办法寻找包含 ORMDL3 基因基本启动子的最小区域。结果发现，当我们把序列从-68bp 截短到-62bp 时，荧光素酶活性迅速下降了 70%到 80%，表明影响 ORMDL3 基因启动子活性的反应元件应该位于-68bp 到-62bp 之间。为了确定到底是哪个转录因子结合在这一区域中影响 ORMDL3 基因的启动子活性，我们用转录因子预测软件 TESS 进行分析，结果发现在转录起始点上游-64bp 到-56bp 区域之间存在一个信号转导及激活转录因子 6（STAT6 ）的结合位点。EMSA 及 super shift 实验表明，在体外情况下 STAT6 能结合在 ORMDL3 基因的启动子上。同时 ChIP 实验也表明，在体内情况下 STAT6 也能结合在 ORMDL3 基因的启动子上。因此，本部分实验结果表明，ORMDL3 基因的基本启动子区域位于转录起始点上游-68bp 以内，并且转录起始点上游 -64bp 到 -56bp 区域之间的一个信号转导及激活转录因子 6（STAT6）的结合位点对 ORMDL3 基因的基本启动子活性起主要作用。第四部分 STAT6 对 ORMDL3 基因的表达调控作用既然 ORMDL3 基因启动子区域中的 STAT6 结合位点对 ORMDL3 基因的基本启动子活性起主要作用，那么 STAT6 对 ORMDL3 基因的表达调控作用具体是怎样的呢？为此，我们构建了 STAT6 的表达载体，在 Jurkat 细胞中转染分别STAT6 表达载体或者 STAT6 的 siRNA，结果发现 STAT6 的高表达或者低表达能显著转录激活或者转录抑制 ORMDL3 基因基本启动子的荧光素酶报告基因活性及内源性 ORMDL3 基因 mRNA 的表达。由于 STAT6 是一个受细胞因子 IL-4/IL-13 调控的转录因子，那么 ORMDL3 基因的表达是否也受 IL-4/IL-13 的调控呢？因此，我们还检测了 IL-4/IL-13 对 ORMDL3 基因表达的影响，结果发现 IL-4/IL-13 处理能显著激活 ORMDL3 基因启动子的荧光素酶报告基因活性及内源性 ORMDL3 基因 mRNA 的表达，一旦干扰掉 STAT6，这一作用就会消失，表明 IL-4/IL-13 对ORMDL3 基因的表达调控作用依赖于 STAT6。另外，由于有研究发现 p300 也能结合在 ORMDL3 基因的启动子上，并且它的结合位点与我们发现的 STAT6 结合位点基本上一致。那么到底是哪个转录因子真正结合在这一区域中呢？因此，我们进行了 ChIP 实验，结果发现 p300 确实也能结合在 ORMDL3 基因的启动子上。于是我们又进一步进行了 IP 实验和 ChIP-Re-ChIP 实验，结果发现 p300 和STAT6 能相互结合，并且它们是以复合物的形式结合在 ORMDL3 基因的启动子上。事实上，p300 是一个协同转录因子，它并不直接结合在 DNA 序列上，而是通过与其他序列特异的转录因子结合而被招募到启动子上。因此，本部分研究结果表明，转录因子 STAT6 能转录激活 ORMDL3 基因的表达，并且 IL-4/IL-13 处理能显著激活 ORMDL3 基因的启动子活性及内源性ORMDL3 基因 mRNA 的表达，并且这种激活作用依赖于 STAT6。事实上，转录因子 STAT6 通过招募协同转录因子 p300，一起调控 ORMDL3 基因的表达。这一研究为 ORMDL3 与炎症及哮喘相关的事实提供了一个合理的解释，同时也为临床上预防和治疗哮喘提供了一个新的途径。关键词：ORMDL3、关联分析、基因表达、转录调控、STAT6The function of ORMDL3 in adult asthma and the mechanism of transcriptional regulation mechanism of ORMDL3Specialty of Study: GeneticsDoctoral Candidate: Rongfang QiuSupervisor: Professor Qiji LiuABSTRACTAsthma is a complex disease triggered by the interaction of genetic predisposition and environmental factors. Recently, the first genome-wide association study (GWAS) of asthma in European subjects identified a novel region containing the ORM1-like 3 (ORMDL3) gene at chromosome 17q21 strongly associated with childhood asthma and ORMDL3 transcript abundance. ORMDL3, located at 17q21.1, belongs to the novel ORM gene family. In yeast this gene family includes two menbers: ORMDL1 and ORMDL2, while in human it contains three menbers: ORMDL1, ORMDL2 and ORMDL3. Breow et al. recently found in yeast Orm proteins as mediators of phingolipid homeostasis and suggested that sphingolipid misregulation might be related to the development of childhood asthma. Knockout of ORM genes in yeast resulted in slower growth and sensitivity to toxic compounds that can be rescued by transfection of human ORMDL3. With a total length of 6560 bp, including 3 exons, ORMDL3 encodes a protein of 153 amino acids with 4 putative transmembrane domains anchored at the endoplasmic reticulum (ER). The gene expression is ubiquitous in human tissues, especially liver and peripheral blood lymphocytes. ORMDL3 was recently found involved in Ca2+ signaling and the unfolded protein response, so it may participate in signaling and facilitating ER-mediated inflammatory responses. ORMDL3 is linked to interleukin 17 (IL-17) secretion: polymorphisms within the 17q21 locus increased ORMDL3 and GSDMB gene expression and elevated IL-17 secretion in cord blood. The 17q21 locus may affect T-cell development during maturation of the immune system and susceptibility to disease. Moreover, ORMDL3 was found associated with type 1 diabetes, primary biliary cirrhosis, glioma, Crohns disease, allergic rhinitis, rheumatoid arthritis, and ankylosing spondylitis. Since ORMDL3 was identified as a new asthma candidate gene, soon, the replication studies were carried out in different populations, and confirmed the relationship between ORMDL3 and asthma. But all of the studies were carried out in childhood asthma, how about the relationship of ORMDL3 and adult asthma? Whether genetic variants in chromosome 17q21 still linked to ORMDL3 transcript abundance in peripheral blood leukocytes or not? How ORMDL3 is regulatied? Or whats the transcriptional regulation mechanism of ORMDL3? With these questions, we carried out our study in following studies. Part one The aAssociation study of genetic variants in chromosome17q21 and adult-onset asthma in a Chinese Han populationTo comfirm the relationship of 17q21, containing ORMDL3, and adult-onset asthma, we recruited 710 adult-onset asthma patients from Qilu Hospital, Jinan.and 656 unrelated, random-sampled healthy controls who were matched to cases by age, ethnicity and geographic region, who underwent comprehensive medical screening at Qilu Hospital and were without symptoms or history of asthma or other pulmonary diseases or atopy. We selected 5 single nucleotide polymorphisms (SNPs) according to previous results and the linkage disequilibrium (LD) status in HCB to do case-control association study，they were：rs7216389，rs12603332，rs12936231 ，rs9303277 ，rs11557467.We found the 5 SNPs significantly associated with asthma (P0.05), of which 2, rs11557467 and rs9303277, were strongly associated (P0.001). Subjects carrying the G allele of rs11557467 or the C allele of rs9303277 showed increased risk of asthma (odds ratio OR 1.27, 95% confidence interval 1.07-1.51, P = 0.006, and OR 1.27,1.07-1.49, P = 0.005, respectively), even after adjusting for age and sex. As conpaired with TCCCG, the risk of asthma was lower for carriers of the haplotype CTGTT (OR 0.81, 0.67-0.97, P = 0.02).That our results demistrated demonstrated that the genetic variants in 17q21 which containing ORMDL3 gene was associated with adult-onset asthma in Chinese Han population.Part twoIdentification Identifying the functional of function SNPs in 17q21 regionAccording to the ensemble database, ORMDL3 contains 2 transcripts: ENST00000304046 (ORMDL3-001) and ENST00000394169 (ORMDL3-002). These two transcripts have same coding region, but different noncoding region, so they transale the same proteins. While, which transcript existed in human tissues? Besides, Moffatt et.al found that the genetic variants in chrosome 17q21 link to ORMDL3 gene expression in EpsteinBarr virus (EBV)-transformed lymphoblastoid cell lines from children in the asthma family, which suggested that the variants which regulating ORMDL3 gene expression may be mediating susceptibility to asthma. So far, none of the variants that associated with asthma located in the coding region of ORMDL3, but one of the SNPs rs12603332, that we selectied in part one, was located in the first intron of ORMDL3. It is known to all that the SNPs located in the intron may affect mRNA splicing. That the aim of this study was: first, to confirm which transcript was exited in different human tissues and second, to assess whether the SNP rs12603332, located in first intron of ORMDL3, affect ORMDL3 gene splicing or not. We conducted this experiment in peripheral blood leukocytes in 10 samples, half of them containing the CC genotype and half the TT genotype in the rs12603332 site. Besides, we also collected human liver tissue, the tissue of esophageal cancer, tissue of carcinoma of large intestine, the tissue of lung cancer, each of them collected 12 samples, and total RNA was extracted from leukocytes by the TRIZOL reagent method (Invitrogen, Carlsbad, CA). According to the character of two transcripts, we designed 2 pairs of primers. One pair, located in the first and second exons, would amplify both transcripts. Another pair, located in the 3 untranslated region of the second transcript, would yield products only when the second transcript was present. The results were similar that in human peripheral blood leukocytes, liver, esophageal cancer, carcinoma of large intestine and lung cancer, that they all express ORMDL3-001 transcript. Only