超氧化物歧化酶的研究与应用论文

超氧化物歧化酶的研究与应用霍荣辉运城学院，运城，2006142121摘要：超氧化物歧化酶(superoxide dismutase， 简称SOD)，是一类广泛存在于生物体内的金属酶，能够催化超氧阴离子自由基(O 2-)发生歧化反应，平衡机体内的氧自由基，己成为化学及生物化学研究领域中热门的研究课题。作为生物体内超氧阴离子自由基的清洁剂，SOD在防辐射、抗衰老、消炎、抑制肿瘤和癌症、自身免疫治疗等方面显示出独特的功能，在医学、食品、化妆品等领域得到越来越多的应用。目前，世界各地学者对SOD的研究方兴未艾，深入研究SOD不仅有着重大的理论意义，也有着重大的实际应用价值。现从分类、分布、结构、性质、催化机理、制备、应用等方面探讨了超氧化物歧化酶的基础研究进展。关键字：超氧化物歧化酶；SOD；自由基；应用；研究1 SOD概述：超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)是一种广泛存在于生物体内，能清除生物体内的超氧阴离子自由基(O 2-)维持机体中自由基产生和清除动态平衡的一种金属酶。具有保护生物体，防止衰老和治疗疾病等作用。1938年Mann和Keilin 1首次从牛红细胞中分离出一种蓝色的含铜蛋白质(Hemocuprein)，1969年Mccord及Fridovich 2发现该蛋白有催化O 2，发生歧化反应的功能，故将此酶命名为超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase，SOD，EC)。现已发现了3种类型的SOD ：Cu/Zn SOD、Mn-SOD、Fe-SOD 3。2 SOD的分布、分类及理化性质2.1 SOD的分布与分类SOD是一类清除自由基的蛋白酶，对需氧生物的生存起着重要的作用，是生物体防御氧毒性的关键。迄今为止，科学家已从细菌、真菌、原生动物、藻类、昆虫、鱼类、植物和哺乳动物等生物体内都分离得到了SOD。基于金属辅基不同，这些SOD至少可以分为Cu/ Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD 三种类型。表1 SOD的分类及分布种 类 颜 色 分子量 分子构象 亚基数 分 布 注: Fe- SOD 也可能存在于真核藻类及植物叶绿体基质中 42.2 SOD的催化机理超氧化物歧化酶作用的底物是超氧阴离子自由基(O 2-)，它既带一个负电荷，又只有一个未成对的电子。在不同条件下，O 2-既可作还原剂变成 O2，又可作氧化剂变成H 2O2，H 2O2又在过氧氢酶(Catalase，CAT)的作用下，生成H 2O和O 2，由此可见，有毒性的O 2-在H 2O2又在过氧氢酶(Catalase ，CAT)的作用下，生成H2O和O 2，由此可见，有毒性的O 2-在SOD和CAT共同作用下，变成了无毒的H2O 和 O2 。超氧化物歧化酶是机体内天然的自由基清除剂，催化超氧阴离子自由基(O 2-)发生歧化反应，清除的超氧阴离子自由基(O 2-)对机体的作用。SOD催化O 2-的反应如下：2O2-+2H+ SOD H2O2+O22H2O2 CAT 2H2O+O2(CAT为过氧化物酶)H2O2+2GSH GSHPX GSSG+2H2O(GSHPX为谷胱甘肽过氧化物酶)3 SOD 的结构和活性影响因素3.1 SOD的结构超氧化物歧化酶(SOD)从结构上可分为两族：Cu/Zn-SOD为第一族，Mn-SOD和Fe-SOD 为第二族。天然存在的SOD ，虽然活性中心离子不同，但催化活性部位却具有高度的结构同一性和进化的保守性，即活性中心金属离子都是与3或4个组氨酸(His)、咪唑基(Mn-SOD含1个天门冬氨酸羧基配位 )和1个H 2O分子呈畸变的四方锥或扭曲的四面体配位。CuZn-SOD作为SOD结构上的第一族，是人们对于SOD 结构研究的突破口，也是人们了解最多的一种 SOD。比较不同来源的Cu/Zn-SOD的氨基酸序列可以发现，它们的同源性都很高 6。有些氨基酸还很保守，在所有序列中都不变，这暗示着这些氨基酸与活性中心有关。Cu/Zn-SOD每个分子由两个亚基通过疏水作用和氢键力缔合成二聚体 ,肽链内部由半胱氨酸C 55和C 144的巯基构成的二硫桥对亚基缔合起重要作用。Richardson用0.2nmX-射线衍射晶体结构分析得到Cu/Zn-SOD三维结构，指出 SOD的活性部位是以Cu 为中心的一个“疏水口袋”( 见图1) 5。Cu /Zn SODMn SODFe SOD蓝绿色粉红色黄色320008000040000- 折叠- 螺旋- 螺旋242真核细胞真核细胞、原核细胞原核细胞图1 天然Cu/Zn-SOD活性中心结构Cu和Zn处在疏水口袋底部，相距约0.63nm。Cu()与四个组氨酸残基咪唑环上N原子配位形成变形的平面四方形结构，其轴向位置上还结合着一个水分子，Zn()则与三个组氨酸和一个天冬氨酸配位形成畸变的四面体结构，Cu()与Zn() 之间通过共同连接一分子组氨酸而形成 “咪唑桥 ”结构。Mn-SOD和Fe-SOD 同属于 SOD结构上的第二族，Mn-SOD是由203个氨基酸残基构成的四聚体，Mn()是处于三角双锥配位环境中，其中一轴向配位为水分子，另一轴向被蛋白质辅基的配位His-28占据，另 3个配基His-83 、His-170和Asp-166位于赤道平面。Fe-SOD的结构比较简单且与 Mn-SOD类似，且活性中心是由3个His，1个Asp和1个H 2O扭曲四面体配位而成 7。3.2 SOD的活性影响因素SOD的催化活性主要与SOD活性中心的氨基酸残基、金属离子及其配位环境、“咪唑桥 ”的变化有关。 SOD活性中心的精氨酸和组氨酸对 SOD的催化活性具有极其重要的意义。这两个氨基酸离中心金属离子非常近,而且均带有正电荷,能诱导底物O2-.，进入活性中心，并可在催化过程中提供H+ 以加快歧化反应速度。如这两个氨基酸残基被破坏或修饰，SOD将会失活。 SOD中心金属离子的作用也不相同。对于Cu/Zn SOD，Zn()的作用一是调节咪唑基与 Cu的相互作用，二是稳定活性中心的结构。若除去酶分子中Zn ()而保留原有环境中时Cu() ，SOD仍有相当高的活性。Cu()与酶催化作用有关,起着传递电子的作用。若除去Cu()，则SOD将会失活，重新加入Cu( ) 后SOD的酶活性恢复。另一方面，Cu()所处的环境对活性有重要影响。若以其它金属离子代替Cu()，同时用Cu() 代替Zn( )，则酶失去全部活性。另外，只有结合态的Cu()才直接与活性有关，但在一定浓度范围内，增加游离的Cu() 的浓度可显著提高SOD活性 8。对“咪唑桥”配合物进行催化的研究表明，在催化过程中，“咪唑桥”在与铜相连的一侧的N原子迅速地发生了质子化和去质子化的变化 9，对酶的催化活性有重要影响。3.3 SOD的活性检测SOD的活性测定方法一般分直接测定法和间接测定法。3.3.1 直接法直接测定法的原理是直接测定SOD催化反应的底物反应速度或产物生成速度。常见的直接测定方法有EPR法、脉冲辐解法、超氧化钾法等。直接法需专用的仪器，故此类方法一般实验室较难应用。应用脉冲射解技术进行毫微秒级快速动力学跟踪，及快速冰冻结合电子自旋共振(ESR)波谱观察，来直接获取SOD和O 2-的动力学信息，如极谱氧电极法。3.3.2 间接法间接测定法是通过某种能产生O 2-的系统，使O 2-进行另一个便于检测的反应，测定特征波长下的光吸收变化速率，计算SOD对这个反应的抑制程度从而间接定量SOD活性。常见的间接测定方法有黄嘌呤氧化酶 -细胞色素C法、邻苯三酚自氧化法、微量邻苯三酚自氧化法、黄嘌呤氧化酶-NBT法、NBT光还原法等。由产生超氧自由基的系统和检测O 2-的系统所组成，如 NBT还原法、黄膘呤氧化酶法和邻苯三酚自氧化法等各种间接法都存在不同程度的问题，应用时应有所考虑。4 SOD 的分离与提取4.1 动物 SOD 的分离提取动物 SOD 是最早为人民所认知的，它的分离提取技术也较为成熟。人民相继从牛、猪、羊、马等动物红细胞、肌肉、肝脏组织中分离和纯化出 SOD。SOD 常用纯化制备方法有离子交换法、疏水色谱法、凝胶过滤法和金属螯合亲和层析法等。以牛血 SOD 提取方法为例，主要有以下几个步骤：溶血液制备、选择性热变性、超滤浓缩、丙酮沉淀、柱层析、冷冻干燥。4.2 植物 SOD 的分离提取由于疯牛病的影响，欧盟规定从 1997 年月 1 月开始，不准使用牛血 SOD 作为食品添剂，植物 SOD 的开发研究开始彰显其重要性。我国近年来在植物 SOD的研究领域有大量相关进展报道。许平 10袁艺 11、赵文芝 12、余旭亚 13等分别从大蒜、桑叶、沙棘、仙人掌中提取出 SOD 并进行相关研究，由于 SOD 活性测定方法并不统一，因此未能进行横向比较。SOD 的提取方法主要有分步盐析法、有机溶剂沉淀法、层析柱法等。4.3 微生物 SOD 的分离提取4.3.1 酵母 SOD 的提取有下列几种方法破壁制备 SOD 粗酶液：超声波处理法（ JC-2 型超声波处理仪处理 5min）、细胞自溶法（提取 5h）、酶裂解法（2%蜗牛酶液，30保温 7.5h）、氯仿- 乙醇法。将酵母菌种进行摇瓶培养，经离心收集后的菌体悬浮在磷酸盐缓冲液中，超声破壁。离心出去残渣，得粗酶提取液。将此液按 5：3的比例加入乙醇、氯仿，搅拌 2h，离心初杂蛋白，上清液加入 0.75 倍冷丙酮，得白色沉淀，将沉淀溶解于 0.025molL-1pH 7.6 磷酸盐缓冲液，透析过夜，除去小分子物质，离心后上 DEAE-32 柱，然后 2.250mmolL-1pH7.6 磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，收集具有 SCD 活性的洗脱液 14。4.3.2 细菌 SOD 的提纯菌体用超声波破菌、3000rmin -1 离心除去核酸碎片，上清液用纸浆过滤，活性部分用 15%饱和度(NH 4)2SO4 盐析、离心收集酶蛋白，用缓冲液溶解，超滤除去小分子物质，上 DE-32 柱(1.59.0cm)，用 00.2 molL-1NaCl 缓冲液梯度洗脱，得到分离的 SOD，冷冻干燥，备用 15。5 SOD 的研究动态5.1 结构性能改造由于受到半衰期短； 相对分子质量大，不易透过细胞膜； 口服时易受胃蛋白酶分解；体内特异性等因素的限制， SOD很难作为药用酶广泛应用于临床中。对SOD进行化学修饰,既能保留天然酶的活性 ,又能提高其稳定性。SOD化学修饰的方法主要有：对SOD的氨基酸残基进行化学修饰，主要是对非活性部位进行修饰,目的是提高其稳定性同时保留较高的生物活性；用水溶性大分子( 如聚乙二醇、聚蔗糖、右旋糖酐和聚烯属烃基氧化物等)对SOD 进行共价修饰以提高酶学特性；对SOD进行酶切改造，降低相对分子质量、减小抗原性。研究表明：经过化学修饰后的SOD基本上保持了天然酶的活性 ,在耐热、耐酸碱和抗胃蛋白酶分解等方面均有很大提高。5.2 SOD 模拟研究5.2.1 活性中心模拟由于天然SOD自身存在的缺点，因此寻找和合成一类既能避免天然 SOD不足，又具有SOD 催化活性的物质SOD模拟物的研究非常活跃。SOD模拟物具有相对分子质量小、稳定性高、在体内半衰期长及脂溶性好的优点。最令人感兴趣的是Cu/Zn-SOD活性中心的模拟，可视为以咪唑桥联的 Cu() 、Zn( )异双核配合物 16。现今对Mn2SOD模拟物的研究逐渐增多，而Fe-SOD 模拟物合成难度较大且SOD活性较低，故其模拟研究较少 17。近年来国内外学者对氨基酸配合物和大环类配合物进行了广泛探讨。谢英等人合成了以二肽为配体的铜-(N-正十二碳酰双甘肽)配合物，这是一个带功能基的长链铜()氨基酸配合物，同时用脉冲辐解法测定了其SOD活性，较好地模拟了 SOD18。毛宗万等人研究了具有Cu/Zn-SOD酶活性中心类似结构的模型化合物，深入地讨论了不同的咪唑桥联方式和不同配位构型对模型化合物催化O2-活性的影响。结果表明，咪唑桥N原子沿四方锥配位底面位置与Cu()配位的模拟物活性大大高于咪唑桥N原子沿四方锥轴向与Cu()配位的模拟物，活性差异的原因很可能与生成Cu()中间体的稳定性有关 19。在多核配合物方面,廖展如等根据天然SOD 活性部位结构合成了多种含苯并咪唑的Cu()、Fe()、Mn ()、Co()、Ni()、Zn ()的配合物，指出配合物活性与其模拟天然SOD结构微环境程度的大小有关，并将其应用于植物抗冷胁迫实验。在进行低温胁迫后，经过SOD模拟物处理对水稻幼苗成活率明显的高于未处理的幼苗 20-25，这些研究成果为研究开发新型农药开辟了新的途径。Patel等合成了一系列以水杨醛丙氨酸席夫碱为配体的 Cu()-Cu()，Cu() -Ni ()，Cu()-Zn( )咪唑桥联的双核配合物和相关的单核配合物并测定其SOD活性。结果表明，双核配合物比单核配合物具有更高的 SOD活性这可能与双核配合物的结构更加类似于天然SOD的活性中心有关 26。5.2.2 胶束模拟由于SOD在生物体内发挥其效用时所处的环境大多是非均相的，一些学者采用表面活性剂在水中形成的胶束体系来模拟上述非均相反应环境。金虬等人的研究表明由CTAB(阳离子型表面活性剂)和SDS( 阴离子型表面活性剂)形成的胶束体系可使多种Cu()-氨基酸配合物的SOD活性得到提高 27。但该体系结构比较复杂，较难弄清其催化O 2-歧化的机理,这方面的研究有待进一步拓展和深化。5.3 SOD 与植物抗逆性植物在生长发育过程中可能受到诸如病原菌、水份、大气污染、辐射、温度、光照盐碱度和重金属等因素的胁迫。这些胁迫均能使植物产生过量的活性氧和自由基,引起细胞结构和功能的破坏。SOD是清除活性氧过程中第一个发挥作用的抗氧化酶,在植物体内起重要作用。近年来，国内外学者对SOD与植物抗逆性之间的关系做了大量研究。任安芝等人对干旱胁迫下内生真菌感染的黑麦草叶中的SOD 及其同工酶进行了系统的研究。研究表明：随着干旱程度的提高，黑麦草叶片中SOD及其同工酶活性显著提高，内生真菌的感染使宿主植物 SOD活性对干旱胁迫的反应更为敏锐 28。这些研究为在沙漠等干旱地区提高植被成活率提供了理论依据和方法。6 SOD的应用和展望6.1 应用6.1.1 SOD在抗衰老中的作用人体随着年龄的增加，皮肤会变得粗糙、发皱、变黑和形成老年斑,其中老年斑是皮肤衰老的典型现象，即在老年人的面部、手部皮肤上出现黑褐色斑块或斑点。老年斑主要由黑色素组成，而自由基在黑色素形成、反应和组成中起重要作用。在有空气存在时，光照黑色素可使其耗氧增加，产生O 2-和羟自由基。反应如下:黑色素 HV 黑色素自由基O2 黑色素 HV O2-在衰老的皮肤和脑中存在的另两类色素是脂褐素和蜡样质，也可使皮肤变黑和粗糙。这两种物质均由自由基引起。脂褐素和蜡样质本身也含大量自由基，可以通过多种途径产生O 2-。自由基虽是造成人体衰老的重要原因，但机体并不是易衰老的，机体内也存在着抗衰老的物质。机体内存在着一系列的自由基清除剂(如: SOD 、CAT、GSH-PX)和一些抗氧化物(如：维生素 A、维生素E、维生素C等)。其中，SOD是非常重要的，它可以不断地清除由光照黑色素耗氧过多而产生的O 2-，防止过多的黑色素的形成。它不断地清除由脂褐素和蜡样质产生的O2-，避免过多的脂质发生过氧化，而减少脂褐素和蜡样质的形成，防止衰老。6.1.2 SOD在疾病治疗中的作用人类机体所处的环境复杂，体内经常不断地产生自由基，特别在病理过程中，产生大量的O 2-，这些O 2-反过来促进病情加重，因而SOD 在清除O 2-中则显得异常重要。肺气肿是由于肺组织的中性白细胞含弹性蛋白酶及弹性蛋白酶抑制剂不平衡所致。弹性蛋白酶抑制剂有-蛋白酶抑制剂及支气管粘膜蛋白抑制剂两种，均可受O 2-攻击而失活，导致肺气肿。环境污染物(如：O 3、氮、硫等)能提高肺的巨噬细胞的活力而不断释放 O2-，吸烟也会使自由基大量进入肺内。在肺中，O 2-产生破坏性极强的 -OH等，O 2-和OH攻击弹性蛋白酶抑制剂，使其失活，而造成肺气肿。类风湿关节炎、全身性红斑狼疮等自身免疫性疾病是由于机体丧失阻止自身组分的抗体形成,而产生自体抗体。这些抗体与正常的机体级组分结合，引起吞噬细胞吞噬而表现出病理状态。吞噬细胞在吞噬过程中产生大量的O 2-，O 2-攻击机体而加剧病变。机体受原子弹、氢弹的辐射冲击，从事放射辐射工作而防护不良的工作人员，受电离辐射后，形成各种不同产物，且产物又发生连锁反应，生成许多自由基而攻击人体，导致辐射病。(人体内) H2O x-射线-射线 x-射线-射线O 2-+OH +HSOD的增加能抑制因辐射而引起的肿瘤的形成，并增加成纤维细胞的分化能力，有效地防止肿瘤的恶性发展。另外，某些药物中毒、氧中毒、大气污染综合症和老年性白内障等疾病的发生均与O 2-相关联。机体内的O 2-可以引起各种疾病，SOD作为O 2-的天然清除剂，在正常情况下 , O2-与SOD 保持动态平衡，但在病理状态下，产生过量的O 2-，机体本身产生的SOD能完全清除这些过多的O 2-，这些过多的O 2-则对机体产生危害。 SOD可以催化O 2-进行歧化反应，减轻O 2-对上述疾病的作用。机体内含有SOD,并且机体组织中的SOD还会随着年龄的增加而增加，如J.Hollander研究 29发现随着人年龄的增加，腓肠肌中SOD 的活性也在增加。但是，机体自身产生的SOD是有限的,因此在疾病治疗中可以通过注射或口服 SOD药物增加机体中的SOD，达到治疗疾病的作用。目前，许多研究者根据SOD的无致敏性和无抗原性的特点，采用 SOD制剂来治疗疾病。如直接注射SOD制剂于发炎的关节部位来缓解类风湿关节炎；口服SOD治疗药物和抗生素中毒已经取得较好的效果； SOD还可促进骨折后细胞分裂、增殖、促进骨折后骨的生长，缩短骨折愈合时间 30。SOD不但可用于疾病的治疗，也可用于临床检查，如用SOD 作为矽肺诊断的指标。矽肺是由于粉尘中的SiO 2引起自由基反应启动膜的脂质过氧化反应而导致膜损伤，引起肺泡巨噬细胞破坏与分解而造成矽肺。通过测定SOD的含量来作为一个矽肺诊断指标。6.1.3 SOD在化妆品中的应用研究证明 31，SOD添加于化妆品中可起到4方面的作用：一是有明显的防晒效果，光照使皮肤变黑的主要原因是氧自由基损害，SOD可有效防止皮肤受电离辐射( 特别是紫外线) 的损伤，从而起到防晒效果；二是SOD 为抗氧酶，能有效防止皮肤衰老、祛斑、抗皱；三是有明显的抗炎效果，对防治皮肤病有一定效果；四是SOD具有一定的防治斑痕形成的作用。6.1.4 SOD在农业上的应用SOD在转基因植物中的过量表达能不同程度地提高植物对逆境的抵抗能力，MnSOD基因的过量表达在一程度上可以提高植物转基因植物对氧胁迫的耐受性。通过基因工程手段，增加植物内的SOD的表达，可以大大增强植物的抗逆性。如 3将存在于线粒体中的Mn-SOD导入烟草、苜蓿的叶绿体后，其转基因植株可以增加对臭氧及干旱胁迫的抗性。拟兰芥 32的Fe-SOD 基因转化烟草叶绿体， Fe-SOD的过量表达能够增强叶绿体质膜和光合系统对MV(甲基紫精) 和高盐过氧化胁迫的抗性。6.1.5 SOD在食品工业中的应用SOD在食品工业中的应用也比较广泛。在食品中加入SOD 可以增强抗衰老、抗炎、抗辐射、抗疲劳等保健作用。SOD还可以在罐头食品、果汁、啤酒等食品中作为抗氧化剂，防止过氧化化物酶引起的食品变质和腐败现象；还可以作为水果和蔬菜的保鲜剂。6.2 展望目前，对SOD分子的修饰、模拟等方面的技术改造已取得了可喜的成果，但是在SOD的应用研究方面，也有一些问题急待解决。如：在临床应用方面，要进一步阐明SOD在体内的抗氧化过程，要延长SOD在体内的半衰期，减少其对机体的毒副作用等； 在食品工业方面，要确保口服 SOD有效性，使之不被胃蛋白酶分解等；在化妆品应用方面，要准确地测定SOD的活性大小，同时要明确化妆品基质对SOD活性和稳定性的影响。如果以上问题能够得到很好的解决，相信SOD的研究与应用必将有个美好的前景，造福人类。参考文献1Nann Teta1. 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