分子生物学题库

1名词解释：1.基因(gene)： 是一段携带功能产物（多肽，蛋白质，tRNA 和 rRNA 和某些小分子 RNA）信息的 DNA 片段，是控制某种性状的的遗传单位。2.基因组(genome)：泛指一个有生命体、病毒或细胞器的全部遗传物质；在真核生物，基因组是指一套染色体（单倍体）DNA。3、端粒:以线性染色体形式存在的真核基因组 DNA 末端都有一种特殊的结构叫端粒。该结构是一段 DNA 序列和蛋白质形成的一种复合体，仅在真核细胞染色体末端存在。4、操纵子:是指数个功能上相关的结构基因串联在一起，构成信息区，连同其上游的调控区（包括启动子和操纵基因）以及下游的转录终止信号所构成的基因表达单位，所转录的 RNA 为多顺反子。5、顺式作用元件:是指那些与结构基因表达调控相关、能够被基因调控蛋白特异性识别和结合的特异 DNA 序列。包括启动子、上游启动子元件、增强子、加尾信号和一些反应元件等。6、反式作用因子:是指真核细胞内含有的大量可以通过直接或间接结合顺式作用元件而调节基因转录活性的蛋白质因子。在反式作用因子中，可直接或间接结合 RNA 聚合酶的，称为转录因子。转录调节因子结构DNA 结合域酸性活域TF 转录激活域 脯氨酸富含域谷氨酰胺富含域蛋白质-蛋白质结合域（二聚化结构域）7、启动子:是 RNA 聚合酶特异性识别和结合的 DNA 序列。8、增强子:位于真核基因中远离转录起始点，能明显增强启动子转录效率的特殊 DNA 序列。它可位于被增强的转录基因的上游或下游，也可相距靶基因较远。9、基因表达:是指生物基因组中结构基因所携带的遗传信息经过转录、翻译等一系列过程，合成特定的蛋白质，进而发挥其特定的生物学功能和生物学效应的全过程。10、信息分子:调节细胞生命活动的化学物质。其中由细胞分泌的调节靶细胞生命活动的化学物质称为细胞间信息分子；而在细胞内传递信息调控信号的化学物质称为细胞内信息分子。11、受体:是存在于靶细胞膜上或细胞内能特异识别生物活性分子并与之结合，进而发生生物学效应的的特殊蛋白质。12、分子克隆:在体外对 DNA 分子按照即定目的和方案进行人工重组，将重组分子导入合适宿主，使其在宿主中扩增和繁殖，以获得该 DNA分子的大量拷贝。13、蛋白激酶:是指能够将磷酸集团从磷酸供体分子转移到底物蛋白的氨基酸受体上的一大类酶。14、蛋白磷酸酶:是具有催化已经磷酸化的蛋白质分子发生去磷酸化反应的一类酶分子，与蛋白激酶相对应存在，共同构成了磷酸化和去磷酸化这一重要的蛋白质活性的开关系统。15、基因工程:有目的的通过分子克隆技术，人为的操作改造基因，改变生物遗传性状的系列过程。16、 载体:能在连接酶的作用下和外源 DNA 片段连接并运送 DNA 分子进入受体细胞的 DNA 分子。17、转化:指质粒 DNA 或以它为载体构建的重组 DNA 导入细菌的过程。18、感染:以噬菌体、粘性质粒和真核细胞病毒为载体的重组 DNA 分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当的细胞，并在细胞内扩增。19、转导:指以噬菌体为载体，在细菌之间转移 DNA 的过程，有时也指在真核细胞之间通过逆转录病毒转移和获得细胞 DNA 的过程。20、转染:指病毒或以它为载体构建的重组子导入真核细胞的过程。21、DNA 变性:在物理或化学因素的作用下，导致两条 DNA 链之间的氢键断裂，而核酸分子中的所有共价键则不受影响。22、DNA 复性:当促使变性的因素解除后，两条 DNA 链又可以通过碱基互补配对结合形成 DNA 双螺旋结构。23、退火:指将温度降至引物的 TM 值左右或以下，引物与 DNA 摸板互补区域结合形成杂交链。24、筑巢 PCR:先用一对外侧引物扩增含目的基因的大片段，再用内侧引物以大片段为摸板扩增获取目的基因。可以提高 PCR 的效率和特异性。25、原位 PCR:以组织固定处理细胞内的 DNA 或 RNA 作为靶序列，进行 PCR 反应的过程。26、定量 PCR:基因表达涉及的转录水平的研究常需要对 mRNA 进行定量测定，对此采用的 PCR 技术就叫定量 PCR。227、基因打靶:是指通过 DNA 定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在生物活体内研究此基因的功能。28、DNA 芯片:DNA 芯片技术是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量的 DNA 探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析，即可获得样品的遗传信息。由于常用计算机硅芯片作为固相支持物，所以称为 DNA芯片。29、错义突变:DNA 分子中碱基对的取代，使得 mRNA 的某一密码子发生变化，由它所编码的氨基酸就变成另一种的氨基酸，使得多肽链中的氨基酸顺序也相应的发生改变的突变。30、无义突变:由于碱基对的取代，使原来可以翻译某种氨基酸的密码子变成了终止密码子的突变。31、同义突变:碱基对的取代并不都是引起错义突变和翻译终止，有时虽然有碱基被取代，但在蛋白质水平上没有引起变化，氨基酸没有被取代，这是因为突变后的密码子和原来的密码子代表同一个氨基酸的突变。32、移码突变:在编码序列中，单个碱基、数个碱基的缺失或插入以及片段的缺失或插入等均可以使突变位点之后的三联体密码阅读框发生改变，不能编码原来的蛋白质的突变。33、癌基因:是细胞内控制细胞生长的基因，具有潜在的诱导细胞恶性转化的特性。当癌基因结构或表达发生异常时，其产物可使细胞无限制增殖，导致肿瘤的发生。包括病毒癌基因和细胞癌基因。34、细胞癌基因:存在于正常的细胞基因组中，与病毒癌基因有同源序列，具有促进正常细胞生长、增殖、分化和发育等生理功能。在正常细胞内未激活的细胞癌基因叫原癌基因，当其受到某些条件激活时，结构和表达发生异常，能使细胞发生恶性转化。35、病毒癌基因:存在于病毒（大多是逆转录病毒）基因组中能使靶细胞发生恶性转化的基因。它不编码病毒结构成分，对病毒无复制作用，但是当受到外界的条件激活时可产生诱导肿瘤发生的作用。36、基因诊断:以 DNA 或 RNA 为诊断材料，通过检查基因的存在、结构缺陷或表达异常，对人体的状态和疾病作出诊断的方法和过程。37、RFLP:即限制性片段长度多态性，个体之间 DNA 的核苷酸序列存在差异，称为 DNA 多态性。若因此而改变了限制性内切酶的酶切位点则可导致相应的限制性片段的长度和数量发生变化，称为 RFLP。38、基因治疗:一般是指将限定的遗传物质转入患者特定的靶细胞，以最终达到预防或改变特殊疾病状态为目的治疗方法。39、反义 RNA:碱基序列正好与有意义的 mRNA 互补的 RNA 称为反义 RNA。可以作为一种调控特定基因表达的手段。40、核酶:是一种可以催化 RNA 切割和 RNA 剪接反应的由 RNA 组成的酶，可以作为基因表达和病毒复制的抑制剂。41、三链 DNA:当某一 DNA 或 RNA 寡核苷酸与 DNA 高嘌呤区可结合形成三链，能特异地结合在 DNA 的大沟中，并与富含嘌呤链上的碱基形成氢键。42、SSCP:单链构象多态性检测是一种基于 DNA 构象差别来检测点突变的方法。相同长度的单链 DNA，如果碱基序列不同，形成的构象就不同，这样就形成了单链构象多态性。43、管家基因:在生物体生命的全过程都是必须的，且在一个生物个体的几乎所有细胞中持续表达的基因。44、基因表达就是基因的转录及翻译，也包括 RNA 基因的转录。基因表达的规律性包含时间特异性和空间特异性。基因表达的方式有组成性表达及可诱导或可阻遏表达。诱导和阻遏表达：可诱导基因在特定环境中表达增强的过程，称为诱导(induction)。如果基因对环境信号应答是被抑制，这种基因是可阻遏基因。可阻遏基因表达产物水平降低的过程称为阻遏(repression)。基因表达的调控（control of gene expression）是指对基因组中某一个基因或一些功能相近的基因表达的开启、关闭和表达强度的直接调节。它是生物在进化过程中逐渐形成的精确而灵敏的生存和应变能力。原核生物基因表达转录激活调控通常通过操纵子模式实现，并且以负性调节为主。而真核生物基因表达调控则更复杂，多是通过反式作用因子（转录调节因子）与顺式反应元件（启动子、增强子、沉默子）的相互作用而实现的，大多数是正性调节。45、SD 序列:转录出的 mRNA 要进入核糖体上进行翻译，需要一段富含嘌呤的核苷酸序列与大肠杆菌 16S rRNA3，末端富含嘧啶的序列互补，是核糖体的识别位点。46、反义核酸技术:是通过合成一种短链且与 DNA 或 RNA 互补的，以 DNA 或 RNA 为目标抑制翻译的反义分子，干扰目的基因的转录、剪接、转运、翻译等过程的技术。47、核酸探针:探针是指能与某种大分子发生特异性相互作用，并在相互作用之后可以检测出来的生物大分子。核酸探针是指能识别特异碱基顺序的带有标记的一段 DNA 或 RNA 分子。48、周期蛋白:是一类呈细胞周期特异性或时相性表达、累积与分解的蛋白质，它与周期素依赖性激酶共同影响细胞周期的运行。49、CAP:是大肠杆菌分解代谢物基因活化蛋白，这种蛋白可将葡萄糖饥饿信号传递个许多操纵子，使细菌在缺乏葡萄糖时可以利用其他碳源。350、顺反子（cistron）在反式构型中不能互补的各突变型所占有的那部分 DNA 片断（见互补测验） 。51、结构域 是指超二级结构在空间上进一步聚集形成的紧密稳定的在蛋白质分子上明显可分的类似球状的结构。52、分子生物学（molecular biology）是在分子水平上研究生命现象、生命本质、生命活动及其规律的学科。53、医学分子生物学 从分子水平上研究人体在正常和疾病状态下的生命活动及其规律，从分子水平开展人类疾病的预防、诊断和治疗研究的一门科学。53、抑癌基因 是指存在于正常细胞内的一大类可抑制细胞生长并具有潜在抑癌作用的基因，当这类基因在发生突变、缺失或失活时可引起细胞恶性转化而导致肿瘤的发生。54、基因文库（gene library，gene bank） 利用限制性内切酶将基因组 DNA 切成片段，每一 DNA 片段都与一个载体分子拼接成重组DNA。将所有的重组 DNA 分子都引入到宿主细胞并进行扩增，得到分子克隆的混合体，这样一个混合体称为基因文库。55、cDNA 文库 将 cDNA 的混合体与载体进行连接，使每一个 cDNA 分子都与一个载体分子拼接成重组 DNA。将所有的重组 DNA 分子都引入宿主细胞并进行扩增，得到分子克隆的混合体，这样一个混合体就称为 cDNA 文库。56、表达载体（expressing vector）是用来在受体细胞中表达（转录和翻译）外源基因的载体。这类载体除具有克隆载体所具备的性质以外，还带有表达构件转录和翻译所必需的 DNA 序列。真核细胞病毒做载体；原核细胞质粒、噬菌体做载体57、重组 DNA 技术 采用载体基因与某目的基因在体外重组的方法克隆 DNA 的技术，称为重组 DNA 技术。过程包括：目的基因的获取、基因载体的选择与构建、目的基因与载体的拼接、重组 DNA 分子导入受体细胞、筛选并无性繁殖含重组体分子的受体细胞以及阳性克隆的表达。58.C 值佯谬：这种生物体的进化程度与基因组大小之间不完全成比例的现象称为 C 值佯谬（ C value paradox ） ； 59.基因家族(genefamily)概念:指核苷酸序列或编码产物的结构具有一定同源性的一些基因。60.基因组学(genomics)：发展和应用基因作图、 DNA 测序、基因定位等新技术以及计算机程序，分析生命体（包括人类）全部基因组结构及功能。61.分子伴侣：是细胞一类保守蛋白质，可识别肽链的非天然构象，促进各功能域和整体蛋白质的正确折叠。 62.信号肽：各种新生分泌蛋白的 N 端有保守的氨基酸序列称信号肽。 63.细胞凋亡（apoptosis)(有树叶凋零之意)或程序化细胞死亡（programmed cell death , PCD) 是指多细胞有机体在正常生理或病理情况下，发生的一种由多基因控制的主动死亡过程。64.凋亡小体:指凋亡的最后阶段，由胞质分割形成大小不等，含有细胞质膜、细胞器及核碎片的膜包被小体。65.DNA 片段化（主）:凋亡细胞 DNA 经琼脂糖凝胶电泳呈特征性梯状条带图谱66.死亡受体(death receptors,DR)：指细胞表面存在的一类能结合凋亡剌激分子，并将信号传递至胞内引起细胞凋亡的受体67.“死亡结构域”概念：是凋亡信号受体共有的、存在于胞内的转导细胞凋亡所必需的一段高度同源的 aa 序列。68.周期蛋白框:各类周期蛋白均含有一段约 100 个氨基酸的保守序列，称为周期蛋白框，介导周期蛋白与 CDK 结合。69.检验点:意指当 DNA 受到损伤时,复制不完全或纺锤体形成不正常，周期将被阻断。70.蛋白质组的含义： 一个基因组、一种生物或一种细胞/组织所表达的全套蛋白质蛋白质组学就是从整体的角度，分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律的一个新的研究领域71.酵母双杂交系统:是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能通过报告基因的表达产物敏感地检测得到。它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。 72.报道株:经改造的、含报告基因的重组质粒的宿主细胞。73.克隆(clone):来自于同一始祖的一群相同分子、细菌、细胞或动物（常被成为副本或拷贝） 。74.克隆化(cloning):获取大量单一拷贝的过程，也称无性繁殖75.DNA 克隆:应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的 DNA）与载体 DNA 接合成一具有自我复制能力的 DNA 分子。继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞。再进行扩增提取获得大量同一DNA 分子，又称基因克隆(gene cloning)或分子克隆(molecular cloing)。 76.载体（vector）：能携带外源基因进入受体细胞, 并在其中进行扩增或诱导外源基因表达的工具。77.质粒:细菌染色质以外的双链环状 DNA，能自我复制和表达其携带的遗传信息。78.限制性核酸内切酶:由细菌自己产生的一种能识别和切割 DNA 内部特定序列的一类核酸酶79.基因组文库(genomic library，G 文库):用基因克隆的方法保存宿主细胞中的 DNA 重组分子中的集合, 所有重组子所含的插入片段的总和代表某种生物基因组全部核苷酸序列。480.cDNA 文库(cDNA library，C 文库):用基因克隆的方法保存在宿主细胞中的 DNA 重组体的群体，每一重组子只含一种 mRNA 信息，这些重组子的总和包含某种生物的全部 mRNA 序列。81.定向克隆:将外源 DNA 片段定向插入到载体中的方法82.TA 克隆定义:利用嗜热聚合酶如 Taq 聚合酶的模板非依赖性末端转移酶活性(在 7075活性高)，使 PCR 产物的 3末端加一个 A 的粘性端，将其直接克隆至 3粘性末端含一个 T 的线性克隆载体中.83.宿主细胞：被导入重组分子的细胞84.转化:质粒 DNA 或以质粒为载体构建的重组 DNA 导入细菌的过程85.感受态细胞:用理化方法人工诱导细胞，使之处于易于吸收和容纳外源 DNA 分子的状态，86.转导:通过噬菌体的释放和感染将 DNA 从一个细胞转移到另一个细胞的过程。87.核酸分子杂交:用一已知的 DNA 或 RNA 片段(探针)来检测样品中未知的核苷酸序列，通过核苷酸间碱基互补的原理互相结合，再经显影或显色的方法，将结合核苷酸序列的位置和大小显示出来。88.探针:用来检测某一特定核苷酸序列或基因序列的 DNA 片段或 RNA 片段89.Southern 印迹杂交:是将经凝胶分离的 DNA 转移到合适的固相支持物，再通过特异性探针的杂交来检测被转移的 DNA 片段的一种技术。90.Northern 印迹杂交:将 RNA 样品变性和通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，再转移到 NC 膜等固相载体上，用标记的 DNA 或 RNA 特异探针对固定在膜上的 RNA 进行杂交。91.核酸原位杂交:以特异性探针与细菌、细胞或组织切片中的核酸进行杂交并对其进行检测的方法, 又称原位杂交组织化学或杂交组织化学。.反转录 PCR ( RT-PCR):是将 RNA 的反转录反应和 PCR 反应联合应用的一种技术92.表位标签:亦称附加表位由短肽序列组成的能显示抗体存在的一个表位，广泛用于分子生物学中附加到转基因蛋白中，翻译产物为融合蛋白，通过免疫组化或 Western 印迹杂交跟踪其表达，不会增加抗体对特异蛋白的反应。93.:基因芯片技术:用已知序列的探针与样品 cDNAs 杂交，杂交信号阳性的探针序列即为细胞中表达的 DNA 序列94.消减杂交法:将实验组 mRNA(或 cDNA)与对照组 cDNA(或 mRNA）杂交，去除杂交体和未杂交上的对照组成分（cDNA 或 mRNA） ，得到的为实验组独有的 mRNA 或 cDNA，这些基因即是差异表达基因。 95.基因治疗:用正常或野生型基因校正或置换致病基因的一种治疗方法称基因治疗96.基因疗法:治疗过程中应用的目的基因就像平常临床上使用的药物一样，为了与传统意义上的基因治疗相区别，通常称之为基因疗法。97.VNTR 多态性:不同个体间重复单元如(CA)n/(TG)n的拷贝数(即出现的频率)不同，因而产生多态性，称为 VNTR 多态性。98.生物芯片：在可识别的有序点阵集合上，试样与每个点阵发生分子间反应或杂交后，通过扫描检测同时获得各个点阵上的作用信息。分子生物学大题一、基因与基因组1.鉴别蛋白质编码基因的五项标准:(1).开放阅读框（open reading frame, ORF）:是始于起始密码子并终于终止密码子的一串密码子。;(2). 序列特征密码子偏爱和剪接点;(3). 序列保守性;(4). 转录产物:寻找基因的表达产物RNA 或蛋白质.;(5). 基因失活。2.真核生物基因组特点:（一）分子量很大的 DNA 与蛋白质形成染色体存在于核内。 （二）转录与翻译不同步，转录产物为单顺反子，功能相关基因分散排布，无操纵子结构。 （三） 基因组存在高比例的非编码序列 (non coding sequence, NCS), NCS 可作进化标尺。 （四） 大量重复序列（repeat sequence）存在。 （五） 基因多为不连续的，被插入序列（IS）所分隔(这种现象称为断裂基因（split gene）. 断裂基因由内含子（intron） （非编码序列）和外显子（exon） （编码序列）交替组成。 （六 ）功能相关基因构成各种基因家族3.重复顺序的功能：1）编码某些重要的功能性蛋白、rRNA、tRNA 等; 2）与染色体构象、着丝粒形成有关; 3）参与基因的表达调控. 分类：1）倒位（转）重复顺序：指两互补顺序呈反向排列，形成回文结构或发夹状结构；2）串连重复顺序：由相同的核心顺序（270bp）成串（头尾相接）排列而成的高度重复顺序。3）散在重复顺序。4.人类基因定位的基本方法:(1).家系分析法发现感兴趣的基因。通过分析统计家系中有关遗传性状的连锁情况和重组率而进行基因定位的方法。;(2).体细胞杂交初步的基因定位;(3). 核酸杂交技术精确的基因定位。克隆基因定位法；原位杂交法；原位 PCR；定位克隆技术。5.基因论：1)相引是两个基因位于同一染色体上，相斥则反之；2)同源染色体在减数分裂时发生交换；3)位置相近的因子相互连锁。6.HGP 的主要成果四张图：1）遗传图:第一代遗传标记是 RFLP（restriction fragment length polymorphism，限制性酶切片段多态性）;第二代遗传标记是STR（short tandem repeat，简短串连重复序列 ） ，6000 个标记;第三代遗传标记是 SNP（restriction fragment length polymorphism，单核苷酸多态性） ，不再是分析长度，而是直接测序52）物理图:以一段已知序列的 DNA 片段（STS，sequence tagged site，序列标记位点）并有染色体定位为路标，以 Mb 或 Kb 为图距的基因组图。3）转录图又称表达序列图或 cDNA 图的路标:是以部分 5 端或 3端 cDNA 序列（即表达序列标签，EST）为路标，根据表达顺序的位置和距离作图4）序列图：测定总长约 30 亿个核苷酸组成的全染色体序列。7.五大模式生物：E.coli、酿酒酵母、黑腹果蝇、秀丽线虫和小鼠，其序列分析被列为 HGP 的内容；8.DNA 多态性及其意义：DNA 多态性:除同卵双生的两个体外，没有两个人的 DNA 组成是完全相同的，即人类 DNA 组成具有多态性。如果比较随机的十个人的常染色体的非编码区,就会发现约 200400bp 就有一个核苷酸不同,这些可变区域即称为 DNA 多态性 (DNA polymorphism)位点。 DNA 多态性标记的价值：1）为路标，构建 DNA 标记的遗传连锁图谱;2）使遗传图谱从直接可见的表型多样性标记进步到 DNA分子本身多态性标记。 DNA 多态性的种类：1）DNA 位点的多态性；2）串连重复顺序多态性；3）单核苷酸多态性2.细胞凋亡的生物学意义：1）具有清除个体发育过程及成熟个体中多余细胞及老化细胞的机体调节作用；2）具有消除对机体有害的癌变细胞及病毒感染细胞的机体防御作用。细胞凋亡是维持个体生存所必需的一种生物学机制。3.Caspase 的性质和种类：Caspase 即天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶。1）已在哺乳类中发现 14 种，分为 3 个亚类： Caspase-1 亚家族，Caspase-2 亚家族，Caspase-3 亚家族；2）根据前体分子(procaspase)N 端的原结构域(prodomain)分为 2 类:启始分子(initiator), 如-8、-9、-10 等，为蛋白酶级联反应的启始者，其活化后再切割和活化下游 Caspase；效应分子(effector),如-3、-6、-7 等，作为上游酶的底物被切割活化，再作用于多种蛋白质或酶，促使细胞凋亡。4.效应 caspase 引起细胞凋亡的机制：1）灭活细胞内凋亡抑制蛋白：非凋亡细胞中, CDA (caspase 活化的 DNAase)与其抑制蛋白(ICDA)结合;凋亡细胞中, caspase 剪切 ICDA; CDA 游离并进入核内降解 DNA,细胞凋亡.2）剪切细胞结构蛋白：如 Caspase 对核板的降解作用; 在凋亡过程中, caspase 在单一位点剪切核纤层蛋白(lamin), 导致核板塌陷, 染色质浓缩.3）剪切效应蛋白: 如参与基因表达蛋白因子,如PARP；4）活化 caspase 抑制剂。5.细胞凋亡的信号传递通路的特点:(1).同一性：各种因素引起的凋亡的形态与生化改变均相同。(2).多样性：环境因素不同，细胞类型不同，或刺激因素不同时，从凋亡程序启动到凋亡发生，其信号传递途径是不同的。(3).分类：百余种凋亡调控因子，正逐渐被组装成一条条的信息传导通路，可分为基本传导通路和非专一性传导通路二类。6.细胞凋亡的信号传递途径:(1)死亡受体介导的细胞凋亡;(2)线粒体相关蛋白的凋亡诱导途径：线粒体跨膜电位(m)的下降，线粒体膜通透性转运孔（MPT）破坏或开放，开放的后果是， m 下降、氧化磷化脱偶联、GSH 耗竭、ROS 产生等，并形成恶习性循环。;(3)细胞核凋亡诱导途径;(4)粒酶 B 介导的细胞凋亡：CrB 由 CTL 分泌进入靶细胞胞浆后,其丝氨酸蛋白酶在胞浆 pH7.0 条件下发挥最佳活性，切割胞浆和核中的多种底物；Caspase 依赖的死亡通路是 CrB 介导细胞死亡的重要途径之一。7.P53 蛋白的调控作用：自 N 端起包括：转录活化区、DNA 结合区、四聚体化区和 C-调节区；1）P53 的表达与活性调节。正常状态下：胞浆 P53 水平很低，半衰期很短；胞内 P53 被严格监控，受 HDM2 的负反馈调节，并通过泛素降解途径调节 P53 水平。异常情况下：当细胞 DNA 损伤、纺锤体丝断裂、癌基因异常表达等细胞生存面临威胁时； P53 水平迅速升高和活化；2）P53 对细胞凋亡和细胞周期的调节作用：野生型 P53 蛋白具维持细胞生长、抑制恶性增殖的作用； P53 蛋白作为“基因警卫”负责维持基因组的完整性、DNA 损伤修复和细胞周期的正常运转；如果损伤不能修复， P53 就激活那些诱导凋亡的基因表达，使细胞进入凋亡状态。突变型 P53 蛋白：丧失抑制细胞恶性增殖功能，p53 基因突变是 50%以上肿瘤逃逸凋亡的重要原因;并且本身具有癌基因功能。8.Bcl-2 家族的功能:(1)属凋亡抑制基因，阻遏细胞凋亡，延长细胞寿命，但对细胞周期和分化无影响.(2)阻止或减少各种刺激引起的细胞损伤。如 Bcl-2 能阻止由 r 射线和多种化疗药导致的细胞凋亡。(3)Bcl-2 蛋白具抗氧化作用;(4)Bcl-2 蛋白抑制细胞器内 Ca2+ 离子向胞质释放，而凋亡必须有 Ca2+ 离子参与。9.bcl-2 家族成员：1）抑制凋亡：bcl-2，bcl-xL，Mcl-1 。2）促进凋亡：bax，bcl-xs ，bad。10. Bcl-2 家族对细胞凋亡的调节机制:(1)Bcl-2、Bax 和 Bcl-x 组成一个凋亡调控系统;(2)当 Bax/Bax 同源二聚体形成时，便诱导细胞凋亡；(3).随 bcl-2 表达量增加，渐多的 Bax/Bax 解聚，形成更稳定的 Bax/Bcl-2 异源二聚体，从而中和了Bax/Bax诱导凋亡的作用。即Bax 和 Bcl-2 比值调节凋亡；(4) 当 Bcl-xs 存在时，优先形成 Bcl-xs/Bcl-2 ，使 Bax/Bax 形式保留，诱导细胞凋亡。11.原位末端标记技术(in situ end lableing, ISEL)：原理: ISEL 的原理是基于细胞凋亡时，DNA 断裂，利用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）或 DNA 聚合酶将带有生物素标记的核苷酸（biotin-16-dUTP）掺入到断裂的 DNA 的 3端，再使其与带有辣根过氧化物酶的抗生物蛋白结合，经 DAB 显色后，便可观察到细胞内是否存在 DNA 片段端存在。主要方法有 2 种: 1）. TdT 介导的 dUTP 缺口末端标记(TUNEL)； 2）. DNA 聚合酶 I 或 klenow 大片段介导的原位的缺口平移(ISNT)。该法特异性和敏感性较高，可检出早期的凋亡细胞.612.与细胞凋亡减少有关的疾病：1）.癌症；2）.自身免疫性疾病，红斑浓疮，免疫介导的肾小管肾炎。3）.病毒感染与细胞凋亡增加有关的疾病：1）.AIDS；2）. 神经退行性病变，帕金森病，老年痴呆；3）再生性障碍贫血；4）.缺血性损伤，心肌梗塞，脑卒中，再灌注损伤；5）.酒精肝13.细胞凋亡自身免疫性疾病：正常情况下：1） 90%以上的淋巴细胞在胸腺内发育都会发生凋亡，那些能识别自身抗原的细胞都应被清除，确保被选择生存下来的淋巴细胞不至于对自身抗原产生免疫应答；2）如果这种选择性清除失败，在靶细胞存在下，淋巴细胞被激活，产生大量的效应细胞攻击靶细胞，导致发生自身免疫性疾病。发病的分子机制：1）淋巴细胞中调节细胞凋亡的一个关键分子是细胞表面受体 Fas（又称 APO 或 CD95） ， Fas 受体与 FasL （配体）结合即可激活凋亡信号传导途径，细胞凋亡；2） T 细胞表面受体 Fas 和 FasL 发生突变时，T 细胞不能发生正常凋亡，导致自身免疫性疾病。3）除系统性红斑狼疮外，还证实类风湿性关节炎、自身免疫性糖尿病、牛皮癣均与淋巴细胞凋亡敏感性改变（Fas 和 FasL 突变）有关。14.细胞凋亡病毒性疾病：病毒的溶解性感染所产生的细胞病变变作用与引发细胞凋亡有关；而病毒的持续性感染与病毒抑制细胞凋亡有关。1）病毒感染引发细胞凋亡：牛疱疹病毒、鸡白血病毒和 HIV 等，均能通过诱导细胞凋亡而引起宿主细胞缺失。如 HIV 感染后引起 CD4+T 细胞凋亡而缺失。2）病毒感染抑制细胞凋亡：许多病毒具有抑制细胞凋亡的机制，有利于建立持续感染、延长病毒复制时间、以最大限度产生子代病毒。如 EB 病毒产生 LMP-1，使 Bcl-2 基因上调；牛痘病毒产生 crmA,可抑制由 caspase 所介导的细胞凋亡。15.细胞凋亡与肿瘤：肿瘤不仅是细胞增殖和分化异常疾病，同时也是细胞凋亡异常疾病。1）大多数肿瘤 P53 突变、而有些肿瘤过度表达Bcl-2 蛋白，这些可有效地以避免细胞凋亡发生。2）P53 蛋白作为“基因警卫”负责维持基因组的完整性、DNA 损伤修复和细胞周期的正常运转。如果损伤不能修复， P53 就激活那些诱导凋亡的基因表达，使细胞进入凋亡状态。3）Bcl-2 属凋亡抑制基因，阻遏细胞凋亡，延长细胞寿命。三、细胞周期调控：1.细胞周期：1）间期：G1 期 (合成前期)； S 期 (DNA 合成期)； G2 期 (合成后期)。 2）分裂期：前期；中期；后期；末期。2.细胞周期调控的主要分子机制：细胞周期引擎异二聚体蛋白激酶复合体，包括二个亚单位：1）调节亚单位：细胞周期蛋白，其浓度随细胞周期不断变化，不仅起激活 CDK 的作用，还决定了 CDK 何时、何处、将何种底物磷酸化；2）催化亚单位：细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶 (CDK)，单独存在时无活性，与 cyclin 结合才具有蛋白激酶的活性。参与细胞周期调控的分子：1）异二聚体蛋白激酶复合体；2）生长因子；3）泛素与 APC：泛素由 76 个氨基酸组成，高度保守，普遍存在于真核细胞，故名泛素；泛素相当于蛋白质被摧毁的标签。4）周期蛋白依赖性激酶抑制因子（CKI） 3.细胞周期的运行：1）细胞周期的启动（G0G1） ；2)DNA 复制（ G0S ） ；3）进入 M 期 (G2-M)； 1）细胞周期的启动：细胞在生长因子的刺激下，Cyclin D 表达，与 CDK4、CDK6 结合而活化激酶?下游蛋白质磷酸化?促进基因的转录2）DNA 复制：CyclinE 与 CDK2 结合-?S-CDK 触发前复制复合体（pre-RC）启动，同时阻止 DNA 再次进行复制.3）进入 M 期 (G2-M)：CyclinA、CyclinB 与 CDK1 结合，形成 M-CDK?CDK-Cyclin 能够积累?CDK1 使底物蛋白磷酸化?细胞分裂.4.检验点由感受异常事件的感受器、信号传导通路和效应器构成，主要检验点有 4 个：1) G1/S 检验点: 在哺乳动物中称 R 点(restriction point)，控制细胞由静止状态的 G1 进入 DNA 合成期，相关的事件包括：DNA 损伤？细胞外环境适宜？细胞体积足够大？2) S 期检验点：DNA 复制是否完成？3) G2/M 检验点：是决定细胞一分为二的控制点，相关的事件包括：DNA 损伤？细胞体积足够大？4)中-后期检验点（纺锤体组装检验点）：任何一个着丝点没有正确连接到纺锤体上，都会抑制 APC 的活性，引起细胞周期中断。四、蛋白质分离纯化1.蛋白质的含量测定方法：1）紫外光谱 (A280)吸收法：色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在 280 nm 附近。大多数蛋白质含有这两种氨基酸残基，所以测定蛋白质溶液280 nm 的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法。注意事项：石英比色杯；调零所用溶液；配制标准蛋白所用溶液；光密度范围。2）Bradford 检测法：考马斯亮蓝 G-250 在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳。蓝色复合物在 595 mn 波长处具有最大光吸收值，并与溶液中蛋白质浓度成正比，因此可检测 595 mn 的光吸收值大小计算蛋白的含量。 缺点：对各种纯化蛋白质反应不同；这种测定方法对蛋白质引起不可逆的变性。 注意事项：标准曲线在 2.5 ug15 ug BSA 浓度范围内保持线性关系；反应 1015 min 后开始出现沉淀，尤其是高浓度蛋白质溶液在酸性条件下易发生沉淀；若选用目的蛋白来做标准曲线或用另一种方法来校正，所测蛋白浓度较准确。3）Lowry 检测法：在碱性溶液中形成铜-蛋白复合物，然后这一复合物还原磷钼酸-磷钨酸试剂(Folin-酚试剂)，产生钼蓝和钨蓝复合物的深蓝色，这种深蓝色的复合物在 745 750 nm 处有最大的吸收峰，颜色的深浅(吸收值)与蛋白质浓度成正比，可根据 750 nm 的光吸收值大小计算蛋白质的含量。 缺点：干扰物质多；反应速度慢；某些试剂不稳定；使蛋白质发生不可逆变性。 注意事项：在加入试剂 30 7min 后呈色达到饱和，时间延长颜色信号减弱；许多干扰物质降低颜色反应；高盐浓度可引起沉淀。4）BCA (二喹啉甲酸)检测法：改进的 Lowry 测定法，反应简单而且几乎没有干扰物质的影响。 原理：在碱性环境下蛋白质分子中的肽键能与 Cu2生成络合物，同时将 Cu2还原成 Cu。而 BCA 试剂可敏感特异地与 Cu结合，形成稳定的有颜色的复合物，在 562 nm 处有高的光吸收值。颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，可根据吸收值的大小来计算蛋白质的含量。 注意事项：与 Lowry 相比，采用 BCA 法时，如果样品中含有脂类物质将明显提高光吸收值；为促进 BCA 法的反应进程，可将样品适当加热。2. 经典的细胞蛋白质分离纯化流程由下述主要步骤组成：(1). 清洗组织或细胞 ;(2). 裂解细胞 ;(3). 离心除去膜组分等获得可溶性蛋白质;(4). 离心、层析、电泳等进一步纯化;(5). 获取产物蛋白。3. 包涵体的成份：包涵体是表达蛋白非天然形式的混合物，包括目的蛋白、宿主细胞蛋白及膜蛋白片段，DNA、RNA 和质粒编码蛋白以及LPS。4. 包涵体的形成原因：表达蛋白不适当的中间折叠体高浓度聚集在一起形成的不溶物。5.影响包含体形成的因素：除分子伴侣和折叠酶外；还与蛋白质本身的性质（形成转角的残基数目及平均带电性等）和生长条件（宿主、培养温度、培养基和 pH 等）有关。6.防止包涵体形成：降低细胞生长温度；共表达分子伴侣；改变渗透压；融合蛋白7.包含体中蛋白质的提取： 用变性剂使之成为可溶性的伸展的肽链，然后再在适当的条件下复性折叠成天然的、有活性的蛋白质分子。8.分离纯化细菌包涵体蛋白的基本步骤：破碎细胞-?分离包涵体-?溶解包涵体（用 68mol/L 或 910mol/L 尿素或 pH2.0 4.5 酸性溶液）-?蛋白质产物的构型复原9.影响电泳迁移率的主要因素：(1)带电颗粒的性质：即净电荷数量、颗粒大小及形状;(2)电场强度：指每厘米的电位降，也称电位梯度，或电势梯度;(3)溶液的 pH 值：决定带电颗粒的解离程度，亦即决定所带净电荷的多少;(4)溶液的离子强度：影响电动电位，缓冲液离子强 度越高，电动电位越小，泳动速度慢;(5)电渗：在电场中，由于多孔支持物吸附水中的正或负离子使溶液相对带电，在电场作用下，溶液就向一定的方向移动.(6)支持介质的选择：(7)其它因素：10.不连续系统原理概要:(1)在不连续电泳系统中，含有三种离子，两种不同孔径的凝胶，两种或两种以上不同 pH 的缓冲溶液.(2)所谓不连续就是指凝胶浓度不一样，缓冲液离子成分及 pH 不一样。(3)在不连续电泳系统中，有三种物理效应，即样品的浓缩效应、分子筛效应及电荷效应。由于这三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高。11.以下为四个不连续性：(1)凝胶层的不连续性：浓缩胶 (stacking gel)； 分离胶 (separating gel(2)缓冲液离子成分的不连续性：快离子(前导离子, leading ion)；慢离子(尾随离子, trailing ion)；缓冲配对离子(缓冲抗衡离子,the buffer counter ion); (3)电位梯度的不连续性：在不连续系统中，电位梯度的差异是自动形成的。(4)pH 的不连续性：浓缩胶 pH：6.7： 分离胶 pH：8.9； 缓冲液 pH：8.3。在浓缩胶与分离胶之间有 pH 的不连续性，是为了控制慢离子的解离度，从而控制其有效迁移率。由于电泳基质的上述四个不连续性，使样品在电泳开始时得以浓缩，然后再被分离。12.SDS-PAGE： SDS 作用：1）SDS 与蛋白牢固结合，由于十二烷基硫酸根带负电荷，使得样品中各种蛋白质与 SDS 形成的 SDS-蛋白质复合物都带有相同密度的负电荷，掩盖了蛋白质分子间天然的电荷差异；2）SDS-蛋白质复合物分子构型也几乎相同，而且具有相同的荷质比，因此在 SDS-PAGE 中，SDS-蛋白质复合物的电泳迁移率只与菌、酵母等的破碎。2）SDS 物理法： A. 超声法：在处理少量样品时操作简便、效率高，液量损失少，适于实验室使用。注意: 超声波产生的化学自由基团能使敏感的活性物质变性失活，另外噪声也比较大。 B.反复冻融法：由于在此过程中易使活性蛋白失活，故适用于提取非常稳定的蛋白质。C.冷热交替法：绝大多数细胞被破坏，一般适用于从细菌或病毒中提取蛋白质。 D. 低渗裂解：是指无胞壁细胞在低渗溶液中通过渗透张力作用裂解的方法，常用于红细胞的裂解3）SDS 化学法：A.有机溶剂法：有些有机溶剂(如苯、甲苯等)可以改变细胞壁或膜的通透性，使内含物有选择性的渗透出来。 B.表面活性剂：常用的有十二烷基磺酸钠、TritonX-100、去氧胆酸钠等。 C.酶解法：必须根据细胞的结构和化学组成选择适当的酶 15.分离方法：1）利用溶解度的差异分离：A.盐析法。 B.有机溶剂沉淀法：有机溶剂能降低溶液的介电常数，从而增加蛋白质分子之间不同电荷的引力，导致溶解度的降低；另外有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，使蛋白质在一定浓度的有机溶剂中沉淀析出。 C.温度。 2）根据分子量的不同分离：.A.透析和超滤； B.平衡离心法； C.凝胶过滤。 3）根据电荷的不同分离：A.电泳； B.离子交换层析 。 4）亲和层析。16.分配定律：1）假设有两种互不混溶的溶剂 S 和 M，将 A 物质溶于一定量的 S 溶剂中，再加入一定量的 M 溶剂；2）A 物质在两相中相互扩散；3）A 物质在两相中达到了平衡(在同一时间内，进出两相的 A 物质的分子数完全相等)时，其分配系数为常数 K=CAS/ CAM。17.塔板理论的要点：1）分配层析柱象分馏柱一样可以分成很多层，每层为一理论塔相对地化学稳定，对 pH 和温度变化较稳定，在很多溶剂中不溶，是非离子型的；2）没有吸附和电渗作用. 通过改变浓度和交联度，可以控制孔径变化在极广泛的范围，并且制备凝胶的重复性8好；3）由于纯度高及不溶性，还适合于少量样品的制备， 不致污染样品。 18 塔板制备：1）原料：丙烯酰胺(Acr)和亚甲基双丙烯酰胺(Bis)；2）催化剂：引发剂（过硫酸铵, (NH4)2S2O8） ，加速剂（四甲基乙二胺, TEMED；3）化学聚合和光聚合两种；4）凝胶浓度和交联度；5）不连续系统制备。 19 踏板可能出现的问题及解决措施：1）条带过淡：上样量不足；染色操作错误；2）条带丢失：电泳时间过长，小条带已跑出胶；胶浓度不正确。3）多余条带：还原剂过量。4）条带模糊：被降解; 药品不纯。5）条带位置错误：被降解；上样量过大；电泳条件不正确；上样前加热不够；还原剂失效。6）条带不整齐：孔径不均一；胶聚合太快，不均一；可能有气泡；样品离子强度过大。7）条带扩散：电压过低，电泳时间过长；缓冲液离子强度太低；样品本身结构不均一。8）条带弯曲：电泳过程产热过多；染色、固定时间短。9）拖尾：样品溶解不充分；胶板不干净。20.蛋白质的浓缩：1）超滤法；2）冷冻干燥法；3）吸收法：聚乙二醇 (PEG)、蔗糖、凝胶等； 4）沉淀法。 五、酵母细胞双杂交1.研究蛋白质相互作用的常用方法：1）酵母双杂交；2）亲和层析；3）免疫共沉淀；4）蛋白质交联；5）基于 GFP 的细胞内蛋白质相互作用的研究方法；6）噬菌体显示系统筛选。2.酵母双杂交系统的基本原理：转录激活因子上有 DNA 结合结构域(BD)与转录激活结构域(AD);单独的 BD 虽然能和启动子结合,但不能激活转录;单独的 AD 也不能激活转录;与调控目的基因有关的两个蛋白质 X 蛋白与 Y 蛋白,将 X 蛋白的编码基因与 BD 结构域基因融合(表达所得的融合蛋白为”诱饵”蛋白), ,Y 蛋白的编码基因与 AD 结构域基因融合(表达所得的融合蛋白称为”猎物”蛋白);如果 X 蛋白与 Y 蛋白之间存在相互作用,那么分别位于这两个融合蛋白(”诱饵”蛋白与”猎物”蛋白)上的 BD 和 AD 就能重新形成有活性的转录激活因子,从而激活相应基因(报告基因)的转录与表达. 通过对报告基因表达产物的检测,反过来可断别作为”诱饵”蛋白与”猎物”蛋白的两个蛋白质之间是否存在相互作用.3.以酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: (1)易于转化、便于回收扩增质粒;(2)具有可直接进行选择的标记基因和特征性报告基因;(3)酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白相互结合4.改造后的酵母细胞的特点：(1)基因组中 GAL4 基因是缺失型的;(2)基因组中引入额外的报告基因 LEU、TRP、HIS; (3)通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落。5.酵母双杂交系统的基本策略：1）表达“诱饵”和“猎物”蛋白；2）检验这两种蛋白表达后能否激活酵母中的报告基因做法：首先构建能表达“诱饵”和“猎物”蛋白的表达载体。该载体中可加入进行营养型筛选的基因。6.酵母双杂交系统的优点：(1)高敏感性；(2)真实性；(3) 简洁性；（4）广泛性。(1)高敏感性。原因：采用高拷贝和强启动子的表达载体，使融合蛋白过量表达；激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物，之后又与启动子结合，此三元复合体使融合蛋白各组分间结合更趋于稳定；通过 mRNA 使信号放大； 检测的结果是基因表达产物的累积效应，可检测存在于蛋白质间的微弱或暂时的相互作用。(2)真实性。检测在活细胞内进行，作用条件与作用力无需模拟，在一定程度上代表细胞内的真实情况。(3)简洁性。融合蛋白相互作用后，减少了制备抗体和纯化蛋白质的繁琐步骤。(4)广泛性。采用不同组织器官细胞类型和分化时期的材料构建 cDNA 文库，能分析不同亚细胞部位和功能的蛋白质，适用于部分细胞质、细胞核及膜结合蛋白。p7.酵母双杂交系统的应用现状：(1)分析已知蛋白之间的相互作用;(2)对蛋白质功能域的分析，如可将待测蛋白质进行点突变或缺失突变再进行双杂交。(3) 用已知功能蛋白质筛选双杂交 cDNA 文库，研究蛋白质之间相互作用的传递途径，发