毒素胁迫对紫茎泽兰挥发物的影响

28卷O8期 Vo128，No08 草 业科学 PRATACULTURAL SCIENCE 14611466 082O11 毒素胁迫对紫茎泽兰挥发物的影响 张红玉 ，杨斌。，何月秋。 (1贵州师范大学生命科学学院，贵州贵阳550001； 2西南林业大学云南省高校森林灾害预警与控制重点实验室，云南昆明650224 3云南农业大学植物病理重点实验室，云南昆明650201) 摘要：本研究通过气相色谱一质谱联用仪(GCMS)分别检测了紫茎泽兰(Eupatorium adenophorum)新鲜叶片、松 针褐斑病菌(Lecanosticta acicola)毒素胁迫紫茎泽兰离体叶片、松针褐斑病菌毒素胁迫紫茎泽兰植株离体叶片的 挥发性化合物的组分。结果表明，1)3种不同处理所得挥发物组分分别为39、6O和53种。2)不同处理所得挥发 性化合物在组分类型和数量上存在差异。毒素胁迫可诱导紫茎泽兰产生多种具有抑茵杀虫活性的组分，意味着 毒素胁迫提高了紫茎泽兰的化学防御能力。3)毒素胁迫不仅单方面影响紫茎泽兰挥发物的释放，还可能对其化 学防御的其他环节存在影响。研究毒素对紫茎泽兰诱导防御的影响，有益于寻找防控外来入侵杂草的有效途径。 关键词：挥发物；化学防御；毒素；紫茎泽兰；GCMS 中图分类号：Q9481；$481 文献标识码：A 文章编号：10010629(2011)081461-06 植物为了有效地保护自身免受病虫害的侵害而 经长期进化产生了一系列化学防御物质。其中，当 植物遭受病原菌侵染、昆虫取食、化学因子、机械损 伤时均能造成某些挥发性组分(volatile organic compounds，VOCs)的大量释放n。在各类挥发性 组分当中，不少组分具有抑菌抑虫活性，可能充当了 直接阻止、抵御病原菌侵染或昆虫取食的化学防卫 因素；有的组分是植物防卫基因表达的高效调节子； 还有的组分是植物自身或植物间传递信息的化学信 号分子，例如植物报警信号(warning signa1)、引诱 捕食性或寄生性天敌信号(guiding signa1)4。作为 植物次生代谢产物，这些挥发物在提高植物自身保 护和生存竞争能力、协调与环境的关系中充当着重 要的角色 ，对植物的化学防御起到重要的作用并 具有重要的生态学意义l_6。 随着研究的深入，人们对挥发物产生、释放及其 在植物化学防御中的作用机制已有越来越多的认 识，尤其对于虫害诱导产生的植物挥发性化合物 (herbivoreinduced plant volatiles，HIPVs)的代谢 调控机制已进行了大量研究8，但对于病原菌毒素 胁迫下植物挥发性组分的研究还比较少。紫茎泽兰 (Eupatorium adenophorum)挥发性化合物本身具 有抑菌活性rg，但松针褐斑病菌(Lecanosticta aci cola)毒素胁迫对于紫茎泽兰挥发性组分及其化学 防御有何影响尚不清楚。本研究测定该毒素胁迫对 紫茎泽兰挥发性组分的影响，探讨毒素胁迫对紫茎 泽兰化学防御可能存在的影响，以期为进一步阐明 松针褐斑病菌毒素对紫茎泽兰的伤害机理和恶草抗 性问题奠定基础。 1材料与方法 11试验材料 供试杂草：紫茎泽兰采自西南林业大学校园内。 供试病原真菌：松针褐斑病菌由福建沙县官庄 林场严重感病的湿地松(Pinus elliottii)松针上分 离得到。经分离、纯化，菌种保存于西南林业大学微 生物实验室。 试验仪器：气相色谱一质谱联用仪(GSMS， FINNIGAN TOP 8000VOYAGER)、水蒸气蒸馏 提取器。 12试验方法 121供试松针褐斑病菌毒素粗提溶液的制备参 照杨斌等r1叩的方法，具体步骤如下： 1)病原真菌产毒培养：挑取经PDA扩繁10 d 后的菌丝，接种于已灭菌并装有250 mL PD培养液 的三角瓶中(每个三角瓶接种菌丝块大小基本一 致)，置于摇床上，转速120 rmin，25下振荡培养 25 d。用垫有双层滤纸的布氏漏斗真空抽滤培养 物，滤去菌丝即得毒素原液。 收稿日期：2011-0411 接受日期：2011-0630 基金项目：国家自然科学基金资助项目(30660106) 作者简介：张红玉(1973一)，女(彝族)，云南石屏人，副教授，博 士，主要从事有害生物防控教学与研究工作。 Email：zh169827sinacom 1462 PRATACULTURAL SCIENCE(Vo128，No08)08201I 2)毒素粗提溶液制备：取毒素原液100 mL，置 于真空旋转蒸发仪内，6O下抽真空旋转将水分蒸 干。然后，分3次共加入300 mL氯仿一甲醇混合溶 剂(氯仿：甲醇一2：3)，40下振荡提取30 rain， 重复3次以便提取充分。合并3次提取液，在40 下经真空旋转蒸去有机溶剂，蒸干后得毒素粗提物， 置于4冰箱中保存备用。用无菌水将毒素粗提物 配制成25 mgmL的溶液，作为供试毒素粗提液。 122供试杂草材料的初处理 自无病虫害的紫茎 泽兰植株摘取生长均匀一致的叶片，先用自来水冲 洗，再用滤纸吸干水分，混合均匀，待用。从以上叶 片中，称取130 g紫茎泽兰新鲜叶片(样品A)；再称 取130 g，置于25 mgmL毒素粗提液中，浸泡48 h 后，滤去毒素粗提液，叶片用蒸馏水冲洗干净，为毒 素胁迫紫茎泽兰离体叶片(样品B)。取一定量的紫 茎泽兰植株，插于25 mgmI 毒素粗提液中，48 h 后，采下叶片，称取130 g，为毒素胁迫紫茎泽兰植株 的离体叶片(样品C)。 123挥发油的提取采用蒸馏萃取法分别对3种 不同处理的叶片材料进行挥发油的提取，萃取溶剂 为石油醚。把材料放入蒸馏萃取装置一端的500 mL圆底烧瓶中，用电热套加热；装置的另一端为盛 有25 mL石油醚的100 mL圆底烧瓶，在60下水 浴加热1 。同时蒸馏萃取4 h，再蒸去石油醚，得到 具有浓烈香味的浅黄色挥发油，样品A、B和C的收 油率分别为020 、089 和019 96。 124挥发油的气相色谱质谱联谱分析GCMS 分析测试条件为，色谱柱HP一5MS(60 ITI 032 mm025肚m)；载气He；流速1 mLmin；进 样温度240；接口温度250；质谱扫描范围为 35455 ainu；离子源EI源；电子能量70 eV。 2结果与分析 3种不同处理方法得到的挥发性成分的气相色 谱一质谱联谱分析总离子流图分别见图1(186个 峰)、图2(259个峰)、图3(232个峰)。以相似度 8O，相对含量O1为数据处理标准，排除一些可 信度不高、含量极少的物质。 21不同样品所产生挥发物的组分差异 经 数据处理，样品A、B、C产生的挥发物组分数分别为 39、6O、53个，样品B为样品A组分数的近154倍， 样品C为样品A组分数的近I36倍，说明松针褐 斑病菌毒素胁迫可诱导紫茎泽兰离体叶片产生更多 的挥发物组分。其中，受毒素胁迫紫茎泽兰离体叶 片较受毒素胁迫紫茎泽兰植株的离体叶片产生的挥 发物组分数更多。 样品A、B、C产生的挥发物当中，相对含量大于 2 的主要组分各有6个、I1个、9个。以样品B所 产生挥发物的主要组分最多，其次为样品c，样品A 相对最少。结果表明，与新鲜离体叶片相比，受毒素 胁迫后，紫茎泽兰离体叶片不仅产生了更多种挥发 物组分，而且相对含量超过2 96的主要组分的个数 也增至新鲜叶片的183倍和150倍。 不同样品所产生的挥发物主要组分及其含量明 显不同(表1)，仅a一红没药醇( 一Bisabolo1)是不同样 品中唯一共有的主要组分，但在不同样品中的含量 有差异。a一红没药醇在样品A、B、C所产生挥发物 当中的相对含量分别为719 、460 、508 ，表 明新鲜叶片中的a一红没药醇明显高于该挥发物在 受毒素胁迫离体叶片和受毒素胁迫植株的离体叶片 当中的相对含量，由此显示出受毒素胁迫后，紫茎泽 兰离体叶片所产生的a一红没药醇相对含量较新鲜 叶片有不同程度的减少。另外，在样品A和样品B 中，a一红没药醇是相对含量最高的组分；在样品C 中，它的相对含量仅略次于乙酸冰片酯。前人研 究n 表明，a一红没药醇具有广谱抗菌作用，也是鸡 血藤(Caulis spatholobi)等多种植物的挥发物当中 相对含量较高的组分。乙酸冰片酯是样品B和样 品C共有的挥发物主要组分，且相对含量均超过 4 ，但该组分不存在于样品A当中，是受毒素胁迫 后才产生的主要组分。 受胁迫离体叶片和受胁迫植株离体叶片产生的 挥发物的组分及其相对含量存在差异，这可能与受 毒素胁迫的部位不同有关，进一步的可能性原因是： 紫茎泽兰不同部位在受到毒素胁迫后产生挥发物的 时间、途径各不相同，最终造成挥发物的组分及其相 对含量因受胁迫部位不同而出现差异。 以往的研究 表明，不同真菌毒素的除草 活性、作用位点、作用机制、致病机理各不相同，结 合本研究结果，可以推断：毒素胁迫杂草的方式不 同或者部位不同，直接影响到杂草合成组分各异、 相对含量不同的挥发物。因此，如果进一步研究 毒素胁迫对杂草化学防御的作用机制或调控机 制，很可能有助于为人们寻求新的杂草除控策略 提供新思路。 082011 草业科学(第28卷O8期) 1463 110 i0 0 90 80 7 0 0 60 一 50 卅4 0 3 0 20 10 OO 120 11O lO O 9 0 8O 7 0 6 0 *50 4 0 3O 2O 1O OO 110 100 90 80 70 0 6 0 一 50 *40 3-0 20 1 0 O0 5O0 1OOO l5OO 2O O0 2500 30 00 35 OO 4000 4500 时间(min) 图1 新鲜叶片内挥发物GC-MS分析总离子流 500 1000 1500 20，00 2500 30 00 3500 4000 45 00 时间(min) 图2 毒素胁迫离体叶片内挥发油GC-MS分析总离子流 500 1000 15 00 2OOO 25 00 30 00 3500 4000 4500 时间(min) 图3毒素胁迫植株叶片内挥发油GC-MS分析总离子流 22不同样品所产生脂肪类、芳香类和萜类 挥发物的差异 经GCMS测试分析，紫茎泽兰 挥发性化合物的基本化学组成为脂肪族化合物、萜 类化合物和芳香族化合物(表2)。这几类植物挥发 性物质大多具有抑菌、杀菌或杀虫活性1 。 ，或者可 以作为植物抵御病原菌侵染的防卫因子及信号分 子。 与样品A相比，受毒素胁迫后，不论是样品B， 还是样品C，脂肪族类和萜类组分数均增加，萜类组 分的增加尤其明显，与此相反，芳香族类组分减少 (表2)。 芳香族化合物(含有苯环)属于碳环化合物(含 有完全由碳原子组成的环)；萜类化合物是具有 (Cs Hs) 通式以及其含氧和不同饱和程度的衍生 1464 PRATACULTURAL SCIENCE(Vo128，No08)08201 1 a一红没药醇(719 )； 1，7，7三甲基一二环庚一2一乙酸乙酯 (485)； 八氢一7一甲基一3一亚甲基一4一(1一甲基乙 基)一1H一环戊二烯一环丙基苯 (298 )； 莰烯(21l )； 1R一(1 ，3a，4p)一4一乙烯基一“，a，4一 三甲基一3-(I-异丙烯基)一环己甲醇 (201 )； B一红没药烯(200) a一红没药醇(46O)； 苯(43O )； 乙酸冰片酯(4O4)； B一红没药烯(367 )； 大根香叶烯(365 )； 莰烯(304 )； (E)一7，11-二甲基一3一亚甲基一1， 6，10一十二烯(279 )； 3一甲基己烷(248 )； 丁香烯(233 )； 异喇叭茶烯(206 )； 乙酸冰片酯(516 )； a一红没药醇(5O8)； 间二甲苯(381 )； 大根香叶烯(368 )； 1一甲基一4-(5一甲基一1一亚甲基一4 己烯基)一环己烯(32O )； 莰烯(272 )； (E)一7，1l一二甲基一3亚甲基一i， 6，i0一十二碳三烯(249 )； 乙基苯(237 )； 8一倍半水芹烯(2O0 ) 反一l，3一二甲基环己烷(226 ) 物，可以看成是由异戊二烯或异戊烷以各种方式连 结而成的一类天然化合物；脂肪族化合物，又称为直 链化合物，其结构特点是碳与碳间连接成不闭口的 链。从某种意义上说，毒素胁迫后挥发性化合物双 键比例减少，是还原反应的结果，挥发性成分大量被 还原，显示有另外的物质发生了氧化反应。 3 讨论 前人研究2 船 表明，由松针褐斑病菌产生的毒 素不仅是寄主松科植物的致病毒素，而且属于非寄 主专化性毒素，能使空心莲子草(Alternanthera philoxeroides)、稗草(Echinochloa crusgalli)表现 出明显的伤害症状，生长受到抑制。此外，该毒素对 外来入侵杂草紫茎泽兰的胁迫研究表明，毒素胁迫 能引起紫茎泽兰过氧化氢酶(catalase)、抗坏血酸过 氧化物酶(ascorbate peroxidase)、超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase)等6种抗病相关酶活性发 生变化L2 ，能诱发紫茎泽兰叶片电解质渗漏_2 ，诱 发钙和钾等矿质元素渗漏2 ，从而影响紫茎泽兰对 病虫害的化学防御能力。 已有文献报道【。 ，紫茎泽兰具有化感作用，本 研究通过对松针褐斑病菌毒素胁迫下紫茎泽兰叶片 气相色谱一质谱联用仪的分析证实了这一点。同时 发现，毒素作用后紫茎泽兰挥发物的成分明显增多， 其中脂肪族类和萜类化合物数量增多，而芳香族化 合物数量减少，这不仅说明松针褐斑病菌毒素胁迫 可诱导紫茎泽兰产生更多的具有抗病虫活性的挥发 性化合物，而且还预示着遭受毒素胁迫后，紫茎泽兰 叶片内出现了剧烈的生理生化反应。过去，从酶的 角度证实过毒素胁迫能引起植物发生异常的生理生 化反应，本研究从小分子代谢产物角度也证实这种 异常反应的存在，化合物差异的巨大还说明，毒素影 响的可能不止是某个反应链，而是整个反应系统。 o82Oli 草业科学(第28卷O8期) 1465 从某种意义上说，松针褐斑病菌毒素胁迫后紫 茎泽兰挥发物双键比例减少，这也从终产物的角度 阐明该毒素诱发紫茎泽兰氧化反应，与过去认为毒 素作用后植物活性氧含量增加的结论一致。病原菌 侵入植物后可诱导活性氧的爆发，并且，活性氧在病 原菌与植物的非寄主互作中较之在寄主互作中的积 累更明显，活性氧的爆发已被认为是寄主防卫反应 之一r2 。某些活性氧可以充当信号分子，在植物遭 受病原菌的初始侵染后传递信号，从而使植物组织 产生一系列的抗病防御反应2 。当然，植物体内 包括酶在内的很多物质对活性氧进发都有重要影 响 ，即便不同的温度条件对活性氧代谢的影响也 有所差异3 。尽管毒素胁迫后紫茎泽兰体内活性 氧代谢变化的真实情况尚待测定，而且活性氧进发 可能是多种活性氧总体的反应结果，但本研究至少 从另一个侧面说明松针褐斑病菌毒素胁迫不仅关系 到对紫茎泽兰抗性的影响，而且还关系到在紫茎泽 兰与病虫害互作过程中起作用的其他因子或环节。 作为植物重要的化学防御途径，挥发性次生代 谢产物在保护植物免遭病原菌、昆虫的侵染中发挥 了重要作用。植物挥发性化合物的组成和含量受到 植物不同基因型和化学型、不同发育时期，以及不同 环境因子的影响31。 ，这些差异与植物化学防御的 关联值得进一步研究。另外，植物挥发性物质是多 种复杂组分的混合物，植物抵御病原菌和植食性昆 虫的策略亦是多组分协同作用的结果。因此，开展 外来人侵杂草挥发性化合物的合成途径、调控机制、 影响因素等方面的研究，进一步阐明挥发物在杂草 化学防御反应中的作用，对研究和寻找除控杂草的 有效途径具有指导意义。 参考文献 1De Moraes C M，Lewis W J P，Par6 W，et a1Herbi yoreinfested plants selectively attract parasitoidsJ Nature，1998，393：570573 23 HamiltonKemp T R，McCracken C T，Loughrin J H， et a1Effects of some natural volatile compounds on the pathogenic fungi Alternaria alternata and Botrytis cinereaJJournal of Chemical Ecology，1992，18(7)： 10831086 31 Obara N，Hasegawa M，Kodama OInduced volatiles in elicitor。treated and rice blast fungus-inoculated rice leavesJBioseienee，Bioteehnologv，and 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