第三章红细胞血型检测

第二章 红细胞血型检测,穆士杰,目 录,第一节 输血前免疫血液学检查第二节 盐水介质试验技术第三节 酶介质试验技术第四节 凝聚胺介质试验技术第五节 抗球蛋白试验技术第六节微柱凝胶介质试验技术,目 录,第七节 吸收放散试验技术第八节 凝集抑制试验技术第九节 红细胞血型分子生物学检测,第一节 输血前免疫血液学检查,重点提示,ABO血型和RhD血型鉴定不规则抗体的筛查和鉴定交叉配血试验,ABO血型和RhD血型鉴定,原理：利用抗原与抗体之间特异性结合的凝集反应来完成。ABO血型鉴定：正定型、反定型。 正定型，检测红细胞表面是否存在A抗原和(或)B抗原；反定型，检测血清中是否存在抗-A抗-B抗体（凝集素）。RhD血型鉴定：红细胞上存在D抗原时，可与抗-D分型血清产生特异性的抗原抗体反应，出现红细胞凝集为RhD阳性，不凝集者为RhD阴性。,不规则抗体的筛查和鉴定,不符合ABO血型系统Landsteiner法则的血型抗体，即抗-A、抗-B之外的血型抗体ABO系统中的亚型，变异型的抗-A1或某种抗-B等抗体包括同种抗体和自身抗体实验方法：盐水介质法、白蛋白介质法、低离子强度介质法(LISS)、酶技术、抗球蛋白试验、凝聚胺(polybrene)促凝技术和凝胶试验（Gel test）等,交叉配血试验,1. 主侧交叉配血：受血者血清(浆)与供者红细胞反应，检测受血者体内是否存在针对供者红细胞的抗体。2. 次侧交叉配血：受血者红细胞与供者血清(浆)反应，检测供者血液中是否存在针对受血者红细胞的抗体。3. 自身对照：受血者红细胞与自身血清(浆)反应，以排除自身抗体、直接抗球蛋白试验阳性及红细胞缗钱状假凝集等干扰试验结果的因素。,第二节 盐水介质试验技术,重点提示,实验原理实验方法结果判读,实验原理,在盐水介质（saline medium）中，IgM类天然抗体分子链较长可直接与含有相应抗原的红细胞结合，并呈现肉眼可见的凝集。仅能检出IgM类抗体，无法检出IgG类抗体。,实验方法,平板法 应用于常规ABO血型和RhD抗原定型，易出现假阳性或假阴性结果。试管法 定型试验或半定量试验，如测定抗体效价，结果准确、可靠。,结果判读,阳性结果 红细胞出现凝集反应或溶血阴性结果 红细胞呈游离的混悬状态溶血 阳性结果,第三节 酶介质试验技术,重点提示,实验原理实验方法,实验原理,作用于红细胞表面的多糖链，减少红细胞表面负电荷，缩短细胞间距，增强IgG抗体与红细胞表面抗原的凝集反应改变红细胞表面结构，暴露出某些隐蔽抗原，使IgG类不完全抗体可以与酶处理的红细胞在盐水介质中发生凝集反应,实验原理,常用：木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶Rh、Kidd血型系统的检出效果最好对M、N、S、s、Fya、Fyb抗原破坏较显著,实验方法,一步法 在血清和红细胞反应体系中直接加入酶液促进抗体与相应红细胞反应，敏感性较差二步法 用酶液消化红细胞后，洗涤去净酶液，增强红细胞抗原性，使不完全抗体与之发生反应，出现特异性凝集,结果判读,阳性对照管凝集，阴性对照管不凝集，被检管出现凝集为阳性，不出现凝集判定为阴性。阳性对照管不凝集或（和）阴性对照管出现凝集，试验失败。分析原因，重新试验。,第四节 凝聚胺介质试验技术,重点提示,实验原理实验方法,实验原理,凝聚胺是一种高价阳离子季铵盐多聚物，可中和红细胞表面的负电荷，引起正常红细胞可逆性的非特异性聚集。加入柠檬酸重悬液(中和液)后，仅由凝聚胺引起的非特异性聚集会因电荷中和而消失灵敏度高，可检出IgM和IgG类抗体,实验方法,两步：红细胞去电荷、红细胞复电荷无抗体致敏的红细胞可在试验过程中产生可逆的非特异性凝集，抗体致敏的红细胞产生的凝集则不可逆试剂：低离子介质、凝聚胺溶液、重悬液,第五节 抗人球蛋白试验技术,重点提示,实验原理实验方法临床应用,实验原理,大部分IgG抗体与具有相应抗原的红细胞在盐水介质中能够特异性结合，但不发生肉眼可见的凝集反应，该类抗体称为不完全抗体抗球蛋白分子的Fab片段可与包被在红细胞上的球蛋白分子的Fc片段结合，从而通过抗球蛋白分子的搭桥作用使不完全抗体与具有相应抗原的红细胞产生肉眼可见的凝集反应,实验方法,经典的血清学试验方法，主要用于检测IgG、IgA等抗体参与的抗原-抗体反应，也可测定补体组分C3、C4片段参与的免疫反应。直接抗球蛋白试验和间接抗球蛋白试验DAT用于检测在患者体内致敏红细胞的不完全抗体和（或）补体。IAT用于检测血清中的不完全抗体，即在体外将人血清与红细胞致敏，再与抗球蛋白试剂反应。,临床应用,DAT：胎母血型不合新生儿溶血病的诊断、免疫溶血性输血反应的调查、自身免疫性溶血性贫血的诊断及药物诱发型溶血病的诊断IAT：血型鉴定、交叉配血、器官移植、妊娠所致免疫性血型抗体以及自身免疫性血型抗体的检出和鉴定,第六节 微柱凝胶介质试验技术,重点提示,实验原理适用范围优点,实验原理,分子筛技术和免疫学技术相结合的产物游离红细胞和凝集红细胞是否能通过特殊结构的凝胶介质，从而使不同状态的红细胞得以分离阴性反应 离心力作用下，未与抗体结合的游离红细胞因体积小通过凝胶层，沉淀于底部，形成“细胞扣” 阳性反应 与特异性抗体结合的红细胞因体积大被凝胶阻滞不能通过凝胶层，留于凝胶介质的顶部或悬浮于凝胶中,适用范围,多用于抗球蛋白试验、ABO血型正/反定型、交叉配血及其他血型系统抗原检测。中性胶 不含抗体，相当于试管的作用特异性胶 含特异性抗体，如抗-A、抗-B，可进行AB抗原检测抗球蛋白胶 含抗球蛋白，可进行IgG类抗体的检测,优点,操作简便、结果准确、灵敏度高、便于保存、节约标本、标准化、使用安全,第七节 吸收放散试验技术,重点提示,吸收试验放散试验临床应用,吸收试验,根据被检标本中所含抗体的最适反应温度，对其进行吸收。冷抗体4反应最强，通常用冷吸收技术，即自身抗体用自身红细胞吸收，同种抗体用对应红细胞吸收，多为IgM抗体温抗体 采用酶处理后的红细胞在37孵育，多为IgG抗体,吸收试验,原理：待检血清抗体加入已知抗原的红细胞，或待检抗原红细胞加入已知效价的特异性抗血清，产生抗原抗体反应，离心后分离经过抗原吸收的血清。将吸收前与吸收后的血清用生理盐水作倍比稀释并测定其效价差异，若吸收后的血清效价低于吸收前，证明待检血清中含有与已知红细胞抗原对应的抗体，或待检红细胞与加入的已知抗原的红细胞血型相同。,放散试验,通过改变物理条件把结合到红细胞膜上的抗体解离下来获得红细胞上致敏的抗体（自身抗体）用于自身吸收获得没有抗体吸附的红细胞，用于血型鉴定和交叉配血,放散试验,试验方法：热放散技术、乙醚放散技术、磷酸氯喹放散技术、冻融放散技术、柠檬酸放散技术、氯仿/三氯乙烯放散技术、二甲苯放散技术,临床应用,鉴定存在于红细胞上的弱抗原，分离、鉴定混合抗体、鉴定新生儿溶血病和免疫性输血反应的抗体等IgM抗体检测时应使用冷吸收、热放散IgG抗体检测时应在37吸收、乙醚放散,第八节 凝集抑制试验,重点提示,凝集抑制试验概念唾液中可溶性ABH血型物质的检测P1、I等血型抗原凝集抑制试验,凝集抑制试验简介,可溶性血型物质：人类血型抗原部分以游离形式存在于血浆、唾液等液体中，如ABH、Lewis、I、P、Chido、Rodger等凝集抑制试验：用于鉴定存在于体液和(或)非红细胞上的可溶性血型物质，利用这些血型物质可以结合相应抗体这一性质，用红细胞检测抗体是否被吸收或中和的情况，以显示相应血型物质的存在。,唾液中可溶性ABH血型物质的检测,原理：人体液中可检出ABH抗原物质，称为分泌型；不存在ABH抗原物质，称为非分泌型。H物质在A、B、O、AB四型分泌型个体唾液中均存在， O型人含量最多适用范围：用于ABO、MN等血型鉴定的辅助试验实验方法：抑制物处理，抗体标化,P1、I等血型抗原凝集抑制试验,原理：当需要确定某些被检血清的抗体特异性时，可用已知血型物质辅助鉴定。如怀疑血清中含有抗-P1时，可用商品化的P1血型物质来确认适用范围：用已知血型物质测定未知抗体的特异性,第九节 红细胞血型分子生物学检测,重点提示,分子生物学检测技术介绍红细胞血型检测中的应用,分子生物学检测技术介绍,基本方法：利用DNA序列的特异性来间接区分等位基因包括：引物延伸法（PCR-SSP）、限制性片段长度多态分析法（RFLP）、PCR-序列特异性寡核苷酸探针（PCR-SSOP）、PCR-单链构象多态（PCR-SSCP）、PCR反向点杂交（PCR-RDB）、PCR-DNA测序、基因芯片及PCR指纹图,红细胞血型检测中的应用,ABO疑难血型的鉴定发现ABO血型新等位基因ABO基因突变的研究新生儿溶血病（HDFN）的辅助诊断某些疾病的病理研究法医个体识别,本章小结,输血前检查的目的是准