国家大学生创新申报书

附件1山东农业大学大学生创新创业训练计划项目申请书（创新训练项目）项目名称不同硫代修饰CPG对鸡只免疫调节作用的研究申请人解云霞学号20120495EMAIL1225595973QQCOM联系电在学院动物科技学院专业年级12级制药工程专业1班指导教师郭慧君职称副教授申报日期2014年6月27日山东农业大学大学生创新创业训练计划管理委员会项目编号41填表说明一、本申请书由申请学生在指导教师或有关专业教师指导下独立填写。申请书要按照要求，逐条认真填写，各项内容必须实事求是，表达明确、严谨。一律要求用打印稿件。二、申请书为A4幅面，于左侧装订成册。一式一份，由指导教师签署意见并经学院评审小组评审，学院审核后，报送教务处。需签字部分由相关人员以黑色钢笔或水笔签名。三、“项目编号”由学校统一编号。四、“学院意见”由项目申请人所在学院填写，应注明研究人员、时间、条件、政策等方面的保证措施和意见。五、如表格不够，可以加附页。一、简表项目名称不同硫代修饰CPG对鸡只免疫调节作用的研究项目覆盖学科或课程药物化学，动物免疫学，动物生理学，细胞生物学依托实验教学中心或实验室国家本科实验教学中心“动物科学与动物医学实验教学中心”项目简介申请经费3000000元起止年月201312201412姓名解云霞学号20120495性别女出生年月199311专业年级班级制药工程2012级1班学院动物科技学院前一学期平均学分绩点36兴趣爱好打羽毛球，读书项目申请人前一学期综合测评名次3电名郭慧君职称副教授研究方向动物免疫调控时间授课名称授课对象学时授课单位2013年上半年动物生理学与实验2012级制药90动科院2013年下半年动物生理学与实验2012级动医90动科院2013年下半年动物生理学与实验2012级动检72动科院主要教学工作简历2012年下半年动物生理学实验2011级动医216动科院时间项目名称获奖情况2011年禽白血病流行病学及防控技术国家科学技术进步奖二等奖2010年禽白血病流行病学及防控技术山东省科学技术进步一等奖指导教师主要科学研究工作简历2006年鸡群免疫抑制病毒多重感染的研究中国畜牧兽医学会奖姓名学号性别出生年月专业年级所在学院学习状况项目中的分工签字赵康20120501男199303制药工程2012级动科学院优秀动物养殖实验赵康项目组主要成员不含申请者刘伟20120477男199402制药工程2012级动科学院优秀样品检测记录数据刘伟二、立项依据（项目的意义、现状分析）人类早期的研究发现，一些细菌和病毒的DNA能诱发机体的免疫反应，但是脊椎动物的DNA却无法激活机体的免疫应答，近几年的研究发现，正是存在于细菌体内的CPGDNA具有免疫激活活性。CPGDNA本质是存在于细菌、病毒和无脊椎动物的DNA中的具有免疫学活性的较短的核苷酸序列。这些核苷酸序列大多数含有以非甲基化胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸（CPG）为基元构成的特定结构，此特定结构即为CPG基序（CPGMOTIF）或免疫刺激序列（IMMUNOSTIMULATORYSEQUENCES，ISS）或者CPGDNA，其在天然细菌和病毒DNA中出现的频率为1/16，但是在脊椎动物中较为罕见，且通常已甲基化。因此细菌CPGDNA可以作为一种“危险信号”被脊椎动物识别，激活机体的免疫系统，这也是机体的免疫系统在长久的进化过程中形成的一种防御机制。而在体外人工合成的含有CPG基序的寡核苷酸（OLIGONUCLEOTIDE，ODN）被称为CPGODN1,2。大量研究显示CPGODNS能激活高等动物的免疫系统，活化B淋巴细胞、巨噬细胞M、树突状细胞DC、自然杀伤细胞NK等免疫细胞，诱导天然免疫应答分泌多种细胞因子，增强抗原的加工提呈，诱导TH1型免疫应答，产生较强的体液免疫和细胞免疫，增强特异性和非特异性免疫反应，临床上可作为哺乳动物免疫治疗剂和免疫增强剂而倍受关注3,4。已在人开展用于治疗肿瘤、过敏反应性疾病、感染性疾病和免疫功能低下的临床试验5,6；其中国外对人免疫刺激活性最强的CPGODN7909被证明是一种高效低毒的新型免疫治疗剂和佐剂，并已申请专利。CPGODN也可以为家禽一些重大疾病防治可以提供重要思路。目前大部分研究主要集中在CPGODN作为免疫佐剂的作用认识。一些研究表明CPGODN作为亚单位疫苗佐剂可以增强抗疟疾寄生虫感染7和提高卵清蛋白抗体滴度8。CPGODN可提高鸡对大肠杆菌和肠沙门氏杆菌抗感染的能力912，增加IBDV疫苗和重组DNA质粒的免疫保护作用13,14；增加NDV疫苗的抗体滴度和淋巴细胞增殖活性，增加AIVH5N1疫苗抗体滴度，显著增加AIV灭活疫苗对鸡肠道分泌型IGA、IGG细胞数量1517；用重组艾美耳球虫蛋白（ETMIC2）和CPGODN接种鸡胚尿囊腔可促进雏鸡生长和降低粪便球虫卵囊排出量18；B型CPGODN作为免疫增强剂对J亚型鸡白血病（ALVJ）的重组蛋白的免疫保护作用，证实其具有增强中和抗体的形成和抗ALVJ早期感染的作用19。一些研究表明，这类核酸免疫增强剂具有结构、种属差异性2022。在癌胚抗原DNA疫苗抗体诱导实验中已经发现经硫代修饰的CPGODN比未经硫代修饰的免疫增强效果好23，但在鸡上对于不同硫代修饰的CPGODN与免疫增强效果之间的关系并未有研究，所以对于经不同硫代修饰的CPGODNS对免疫细胞活性，细胞因子分泌的影响我们不得而知。因此本实验小组希望通过进行实验筛选出不同硫代修饰的对于鸡具有最佳免疫刺激活性的CPGODN，为其在家禽疫病预防与生产中应用提供依据。主要参考文献120BROWNLIER,ZHUJ,ALLANB,MUTWIRIGK,BABIUKLA,POTTERA,GRIEBELP2009CHICKENTLR21ACTSASAFUNCTIONALHOMOLOGUETOMAMMALIANTLR9INTHERECOGNITIONOFCPGOLIGODEOXYNUCLEOTIDESMOLECULARIMMUNOLOGY46316331702KEESTRAAM,DEZOETEMR,BOUWMANLI,VANPUTTENJPCHICKENTLR21ISANINNATECPGDNARECEPTORDISTINCTFROMMAMMALIANTLR9JIMMUNOL201018514604673TOKUNAGAT，YAMAMOTOH，SUGANUMAT，ETA1ANTITUMORACTIVITYOFDEOXYRIBONUCLEICACIDFRACTIONFROMMYCOBACTERIUMBOVISBCGIJISOLATION，PHYSICOCHEMICAICHARACTERIZATION，ANDANTITUMORACTIVITYJJNCI，1984，729559624YAMAMOTOS，YAMAMOTOT，TOKUNAGAT，ETA1DNAFROMBACTERIABUTNOTFROMVETEBRATESINDUCESINTERFERONS。ACTIVATESNATURALKILLERCELLSANDINHIBITSTUMORGROWTHJMICROBIOLIMMUNOL，1992，369J9839975LEONARDJP，LINKBK，EMMANOUILIDESC，ETALPHASEITRIALOFTOLLLIKERECEPTOR9AGONISTPF3512676WITHANDFOLLOWINGRITUXIMABINPATIENTSWITHRECURRENTINDOLENTANDAGGRESSIVENONHODGKINSLYMPHOMAJCLINCANCERRES，2007，1320616861746COOPERCLDAVISHL，MORRISML，ETALCPG7909，ANIMMUNOSTIMULATORYTLR9AGONISTOLIGODEOXYNUELEOTIDE,ASADJUVANTTOENGERIXBHBVVACCINEINHEALTHYADULTSADOUBLEBLINDPHASEI/IISTUDYJJCLINLMMUNOL，2004，2466937017SUZ,TAMMF,JANKOVICD,STEVENSONMMVACCINATIONWITHNOVELIMMUNOSTIMULATORYADJUVANTSAGAINSTBLOODSTAGEMALARIAINMICEINFECTIMMUN20037195178878VLEUGELSB,VERVERKENC,GODDEERISBMSTIMULATORYEFFECTOFCPGSEQUENCESONHUMORALRESPONSEINCHICKENSPOULTSCI20028191317219GOMISS,BABIUKL,GODSONDL,ALLANB,THRUSHT,TOWNSENDH,ETALPROTECTIONOFCHICKENSAGAINSTESCHERICHIACOLIINFECTIONSBYDNACONTAININGCPGMOTIFSINFECTIMMUN20037128576310HEH,GENOVESEKJ,SWAGGERTYCL,NISBETDJ,KOGUTMHINVIVOPRIMINGHETEROPHILINNATEIMMUNEFUNCTIONSANDINCREASINGRESISTANCETOSALMONELLAENTERITIDISINFECTIONINNEONATALCHICKENSBYIMMUNESTIMULATORYCPGOLIGODEOXYNUCLEOTIDESVETIMMUNOLIMMUNOPATHOL2007117342758311HEH,LOWRYVK,SWAGGERTYCL,FERROPJ,KOGUTMHINVITROACTIVATIONOFCHICKENLEUKOCYTESANDINVIVOPROTECTIONAGAINSTSALMONELLAENTERITIDISORGANINVASIONANDPERITONEALSENTERITIDISINFECTIONINDUCEDMORTALITYINNEONATALCHICKENSBYIMMUNOSTIMULATORYCPGOLIGODEOXYNUCLEOTIDEFEMSIMMUNOLMEDMICROBIOL200543181912MACKINNONKM,HEH,SWAGGERTYCL,MCREYNOLDSJL,GENOVESEKJ,DUKESE,ETALINOVOTREATMENTWITHCPGOLIGODEOXYNUCLEOTIDESDECREASESCOLONIZATIONOFSALMONELLAENTERIDITISINBROILERCHICKENSVETIMMUNOLIMMUNOPATHOL200912734371513WANGX,JIANGP,DEENS,WUJ,LIUX,XUJEFFICACYOFDNAVACCINESAGAINSTINFECTIOUSBURSALDISEASEVIRUSINCHICKENSENHANCEDBYCOADMINISTRATIONWITHCPGOLIGODEOXYNUCLEOTIDEAVIANDIS200347413051214MAHMOODMS,SIDDIQUEM,HUSSAINI,KHANA,MANSOORMKPROTECTIONCAPABILITYOFRECOMBINANTPLASMIDDNAVACCINECONTAININGVP2GENEOFHIGHLYVIRULENTINFECTIOUSBURSALDISEASEVIRUSINCHICKENSADJUVANTEDWITHCPGOLIGODEOXYNUCLEOTIDEVACCINE2006242248384615ZHANGL,TIANX,ZHOUFVACCINATIONWITHNEWCASTLEDISEASEVACCINEANDCPGOLIGODEOXYNUCLEOTIDESINDUCESSPECIFICIMMUNITYANDPROTECTIONAGAINSTNEWCASTLEDISEASEVIRUSINSPFCHICKENVETIMMUNOLIMMUNOPATHOL2007115342162216ZHANGX,YUQ,ZHANGX,YANGQCOADMINISTRATIONOFINACTIVATEDAVIANINFLUENZAVIRUSWITHCPGORRIL2STRONGLYENHANCESTHELOCALIMMUNERESPONSEAFTERINTRANASALIMMUNIZATIONINCHICKENVACCINE2009274156283217WANGY,SHANC,MINGS,LIUY,DUY,JIANGGIMMUNOADJUVANTEFFECTSOFBACTERIALGENOMICDNAANDCPGOLIGODEOXYNUCLEOTIDESONAVIANINFLUENZAVIRUSSUBTYPEH5N1INACTIVATEDOILEMULSIONVACCINEINCHICKENRESVETSCI200986339940518DALLOULRA,LILLEHOJHS,KLINMANDM,DINGX,MINW,HECKERTRA,LILLEHOJEP2005INOVOADMINISTRATIONOFCPGOLIGODEOXYNUCLEOTIDESANDTHERECOMBINANTMICRONEMEPROTEINMIC2PROTECTSAGAINSTEIMERIAINFECTIONSVACCINE,233108311319窦文文,李宏梅,成子强,刘建柱,刘海港,井维芳,崔治中,郭慧君ALVJGP85重组蛋白与免疫佐剂联合接种雏鸡诱导免疫保护的研究中国预防兽医学报353232236,201320王瑾，张王刚CPGODN序列结构特征对免疫活性影响的研究进展。细胞与分子免疫学杂志。2008,24（12）1219122121RANKINR，PONTAROLLAR，IOANNOUX，ETA1CPGMOTIFIDENTIFICATIONFORVETERINARYANDLABORATORYSPECIESDEMONSTRATESTHATSEQUENCERECOGNITIONISHIGHLYCONERVEDJANTISENSENUCLEICACIDSDRUGDEV，2001，1L53334334022HEH，CRIPPENTL，FARNELLMB，ETA1IDENTIFICATIONOFCPGOLIGODEOXYNUCLEOTIDEMOTIFSTHATSTIMULATENITRICOXIDEANDCYTOKINEPRODUCTIONINAVIANMACROPHAGEANDPERIPHERALBLOODMONONUCLEARCELLSEJDEVELOPMENTALANDCOMPARATIVEIMMUNOLOGY，2003，27662162723杨璇，陈宗德，付庆硫代修饰的CPG基序及IL_2表达质粒对癌胚抗原DNA疫苗诱导抗体的影响三、项目实施方案及实施计划（实施方案、实施办法、具体实施计划及可行性分析）（一）实施方案1研究普通CPGODN对于鸡体内外免疫细胞活性及细胞因子分泌的影响，确定各项指标最佳测定时间。2设计不同硫代修饰程度的CPGODN，对SPF鸡进行体内外试验，测定对于免疫细胞活性及细胞因子分泌的影响。（二）实施办法1体外筛选试验用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测外周血淋巴细胞转化效果和脾细胞的增殖能力，通过测得的OD570算出淋巴细胞增殖指数（SI），筛选不同硫代化修饰的CPGODNS的免疫刺激作用。2动物接种试验21用不同硫代修饰的CPGODN联合禽流感病毒（AIV）亚单位疫苗和新城疫病毒（NDV）灭活疫苗进行免疫雏鸡，进行血清AIV抗体和NDV抗体检测。22淋巴细胞转化试验取脾脏，检测脾细胞刺激转化指数。23受体表达检测取脾脏提RNA，进行荧光定量PCR测TLR21表达量。（三）具体实施计划设计三种不同硫代修饰程度的CPG，此三种CPG分别命名为CPGA、B、C，委托上海生工生物有限公司合成。2013年12月2014年3月不同硫代化修饰CPGODNS体外筛选。1MTT法检测鸡外周血淋巴细胞增殖反应。2MTT法检测鸡脾脏细胞增殖反应。2014年3月2014年6月不同硫代化修饰CPGODNS与疫苗联用进行体内免疫。2014年6月2014年10月血清采集并进行各项试验指标的检测。1血清ALVJ抗体检测。2血凝及血凝抑制试验检测H5抗体滴度。3MTT法检测脾细胞增殖反应。4荧光定量检测接种鸡只脾脏TLR21表达量。2014年10月2014年12月试验结果分析、总结。5实验技术路线（四）可行性分析1、研究显示，CPGODN的免疫活化作用在人体外试验、小鼠体内外试验及猪体外试验中均得到了验证，为本试验以鸡为实验对象提供了理论上的可行性。2、所采用的研究方法是常规分子生物学技术、免疫学技术和细胞体外培养技术，这些技术经过培训均能掌握并能熟练运用。为本课题的开展提供技术方法的保障。3、山东省重点实验室创新平台和基础兽医学实验室具有的试验条件和设备为本课题开展提供较好的外部条件。4、本课题小组成员均为动物制药专业的学生，学习成绩和平时表现优秀，更为重要的是这些学生积极主动性高，对此研究项目非常感兴趣，这是开展本研究能够顺利完成研究任务的重要前提。5、小组成员已经学习了动物生理学、免疫学、微生物学和分子生物学等相关专业课程，并熟练掌握了相关专业基础知识，为该项课题的顺利进行奠定了坚实的理论基础。四、预期成果1、对研究结果的总结和分析，预期可以发表一篇具有学术价值和应用价值的研究论文。2、项目小组骨干成员参加学术论坛交流一次。3、在本研究实施过程中，研究小组各个成员都可以得到专业性训练，掌握常规分子生物学技术、免疫学技术和细胞体外培养技术，同时对不同构型的CPGODN对于免疫细胞活性及细胞因子分泌的影响有更为深入的了解。五、本项目的特点与创新之处特点1、实用性。CPGODN是一种新型核酸免疫调节剂，具有对人和动物一些重大疾病进行免疫治疗和预防的巨大潜力，通过本研究可以深入了解CPGODN结构与功能之间的相互关系，为家禽疫病防控提供新的思路。2、专业性强。本研究结合细胞培养技术和免疫学技术，所研究的对象和使用方法都是与兽医专业相关的，同时是多种学科知识和研究方法的综合，对每个同学现阶段的学习和将来工作就业都是大有裨益的。创新之处1目前国内外文献显示，对于研究CPGODN的构效关系尚未以鸡为实验对象进行任何体内及体外试验，故本试验具有试验理论研究上的创新性。2通过本课题的综合研究，可了解不同硫代化修饰对CPGODN生物活性的影响，筛选具有最佳免疫刺激活性、最佳性价比的CPGODN，对于提高鸡群的免疫能力有重大意义，具有实践应用上的创新性。六、项目研究基础1、主持人与本项目相关的专业知识积累和已取得的成绩。2、指导教师的教学、科研工作积累和已取得的工作成绩。3、项目组成员的学习情况。（一）主持人通过查阅与本课题研究相关材料，了解大量研究背景，掌握了CPGODN的体外免疫刺激作用，CPG0DN在动物实验中对疫苗的增效作用，不同CPG寡聚核苷酸序列对免疫作用的影响以及实验室细胞因子的检测等方面的知识，虽然尚没有学习动物免疫学课程，却积累大量相关方面的知识，为专业课的学习提供背景材料。（二）指导教师为郭慧君副教授，为硕士生导师。自2003年一直从事与禽类疾病有关的研究，2006年完成与鸡白血病有关的博士研究课题，获得博士学位，毕业后得到校博士基金支持继续进行相关研究。在中国农业科学、畜牧兽医学报、中国兽医学报以及农业生物技术学报等国家一级学术期刊发表研究性论文10余篇。获国家级学会奖励一次（第一位），目前指导研究生3名。（三）项目组成员的学习情况本实验组同学在学习过程中，注重对知识的理解，注重对知识的联系，不懂就问，勤思好学；在实验过程中，注重实验操作的过程，注重对实验结果的分析，胆大心细，态度严谨。因此各科成绩均达到了学校及老师的要求，并